بررسي خصوصيات بيوفيزيكي و الكتروفارماكولوژيكي تك كانال mitoKATP در غشا داخلي ميتوكندري مغز موش صحرايي

Biophysical and electropharmacological properties of single mitoKATP channel in rat brain mitochondrial inner membrane

مقدمه: كانالهاي پتاسيمي حساس به ATP مختلفي در غشا داخلي ميتوكندري شناسايي شده‌اند. اين كانالها در فرآيندهاي سلولي همچون حفاظت سلولي نقش دارند. در‌ اينجا ما خواص بيوفيزيكي و الكتروفارماكولوژي يك كانال KATP را در غشا داخلي ميتوكندري مغز گزارش نموده‌ايم. روش‌ها: مغز موش بزرگ آزمايشگاهي بالغ بعد از برداشتن، هموژنيزه و محلول آن در طي مراحل MSE-ديژيتونين، آب، و بيكربنات سديم سانتريفيوژ و وزيكول‌هاي غشا داخلي ميتوكندري جدا گرديد. فسفاتيديل كولين از زرده تخم مرغ استخراج گرديد. غشا در منفذي به قطر µm 150 تشكيل شد. سيگنالهاي ثبت تك كانال kHz 1 فيلتر و با سرعت نمونه برداري kHz 10 ذخيره گرديدند. اطلاعات با نرم افزار Pclamp 10 آناليز گرديدند. يافته‌ها: ثبت‌ تك‌كانال، كانالي با كنداكتانس 143±pS7 و وابسته به ولتاژ را در محيط غلظتي 200mM KCl cis/50 mM KCl trans نشان داد. توزيع‌هاي زماني وضعيت بسته، يك جز تواني را براي ولتاژهاي مثبت و دو جز تواني را براي ولتاژهاي منفي نشان داد. توزيع‌هاي زماني وضعيت باز بر دو جز تواني باز بودن منطبق بود. مهار كانال توسط ATP و از مشخصه‌هاي كانال، بعنوان كانال KATP بود. 4-AP و TEA فعاليت كانال را مهار نموده ولي فعاليت كانال تحت تاثير ايبريوتوكسين و كاريبوتوكسين بعنوان مهاركننده‌هاي كانال BK تغيير پيدا نكرد و 5-هيدروكسي‌دكانوييك اسيد بعنوان بازدارنده كانال پتاسيمي حساس به ATP كانال را تحت تاثير قرار نداد. وسترن‌بلات و استفاده از آنتي‌بادي‌هايي بر ضد زيرواحدهاي Kir6.1 و SUR2B، پروتيينهايي با وزن مولكولي ~55-64 kDa و ~120 kDa را مشخص نمود. نتيجه گيري: نتايج ما حضور كانال KATP را در ميتوكندري مغز نشان مي‌دهد. اين كانال احتمالاً نقش مهمي در هميوستازي ميتوكندري مغز دارد.

Introduction: Different ATP-sensitive potassium channels have been detected in the mitochondrial inner membrane of cells. They are suggested to be involved in cell processes including cell protection. Here, we characterized the biophysical and electropharmacological properties of a KATP channel in the brain mitochondrial inner membranes. Methods: After removing and homogenizing the rat brain, the supernatant was separately centrifuged in MSE digitonin, H2O and Na2CO3 and mitochondrial inner membrane vesicles were obtained in MSE solution. L-?-Phosphatidylcholine (membrane lipid) was extracted from fresh egg yolk. Bilayer lipid membranes were formed in a 150 ?m diameter hole. All recordings were filtered at 1 kHz and stored at a sampling rate of 10 kHz for offline analysis by PClamp10. Results: Single channel recordings revealed a channel with a slope conductance of 143 ± 7pS in voltage dependent 200 mM KCl cis/50 mM KCl trans. The closed dwell time distributions indicated one and at least two exponential components at positive and negative potentials, respectively. The open dwell time events were fitted to two exponential functions. The block by ATP and glibenclamide characterized this channel as the KATP channel. We also showed that 4-AP and TEA inhibited the channel activities. The activity of channel was not influenced by iberiotoxin, a BK channel blocker, and 5-hydroxydecanoic acid, an inhibitor of mitochondrial ATP-sensitive potassium channels. Western blotting with antibodies directed against Kir6.1 and SUR2B subunits recognized a blocking-peptide-sensitive with a molecular mass of ~55-64kDa and ~120kDa, respectively. Conclusion: This channel is likely to be involved in maintaining proper homeostasis in brain mitochondria and cell processes.