انتخاب مناسب‌ترين ژن‌هاي رفرنس جهت مطالعات Real-time PCR در مراحل ابتدايي زيست تاسماهي ايراني، Acipenser persicus

Selection of suitable reference genes for real-time PCR studies of early developmental stages of sturgeons

در مطالعاتي كه از تكنيك PCR Real-time كمي استفاده مي شود، به منظور كمي سازي داده هاي حاصل از اندازه گيري سطوح mRNA مي بايست ميزان mRNA ژن هدف را نسبت به ميزان mRNA يك ژن رفرنس داخلي نرمال سازي كرد. از آنجا كه سطح بيان ژن كنترل داخلي مي بايست در بين بافت‌هاي مختلف و نيز تمامي مراحل رشد يك موجود زنده ثابت بوده و نيز تحت تاثير تيمارهاي آزمايش قرار نگيرد، در هر يك از آزمايش هاي بيان ژن مي بايست ثبات و پايداري بيان چندين ژن رفرنس مورد آزمايش و ارزيابي قرار گيرد تا مناسب ترين ژن رفرنس به منظور نرمال سازي داده هاي حاصل از بيان ژن هدف انتخاب گردد. در مطالعه حاضر ثبات بيان شش ژن رفرنس شامل actin- beta (ACTB)، Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)، Ribosomal protein L6 (RPL6)، Ubiquitin (UBQ)، Ribosomal protein L13 (RPL13) و Elongation factor 1-alpha (EF1A) در طي مراحل ابتدايي رشد و تكامل تاسماهي ايراني با استفاده از تكنيكReal-Time PCR TaqMan مورد ارزيابي قرار گرفت. برآيند كلي نتايج حاصل از نرم افزارهاي geNorm، Bestkeeper و NormFinder نشان داد كه دو ژن RPL6 و ACTB از بيشترين ثبات بيان ژن برخوردار بودند، در حاليكه ژن RPL13 بيشترين تغييرات بيان ژن را از خود نشان داد. بر اين اساس استفاده از ژن هاي RPL6، ACTB و نيز ميانگين هندسي آنها به منظور نرمال سازي داده هاي بيان ژن هدف در مراحل ابتدايي رشد و تكامل تاسماهي ايراني و نيز ساير گونه هاي تاسماهيان توصيه مي شود.

In quantitative real-time PCR, the mRNA level can be quantified in relative terms based on the expression ratio of mRNAs of the target gene and an internal reference gene. Since, an internal standard should be expressed at a constant level among different tissues of an organism at all stages of development, and should be unaffected by the experimental treatment, the stability of different reference genes needs to be tested for every new experiment to select the most suitable reference gene for normalization of target gene. Here in this study, the stability of six candidate reference genes including ribosomal protein L6 (RPL6), ribosomal protein L13 (RPL13), Elongation factor 1-alpha (EF1A), Ubiquitin (UBQ), Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and beta-actin (ACTB) were studied during early development of Persian sturgeon, Acipenser persicus using Real-Time PCR TaqMan. The general consensus from BestKeeper, NormFinder and geNorm models indicate that RPL6 and ACTB were found to be the most stable reference genes across the different developmental time-points, whereas RPL13 was the most variable gene. Using RPL6, ACTB and a two-gene normalization factor based on the geometric average of RPL6/ACTB could be recommended for standardization of qPCR data in future developmental studies of Persian sturgeon and likely in other Acipenserid species.