كلونينگ و بررسي بيان ژن كد كننده BMP-2 انساني در باكتري E. coli به منظور توليد يك داروي نوتركيب

Cloning of BMP-2 Gene and Its Expression Study in E. coli in Order to Produce a Recombinant Drug

مقدمه و هدف: پروتيين هاي مورفوژنتيك استخواني، گروهي از سايتوكاين هاي متعلق به ابرخانواده TGFB مي باشند. اين پروتيين ها در تكامل بسياري از ارگان ها و بافت ها، طي دوران جنيني و پس از آن در ترميم و بازسازي بافت هاي استخوان و غضروف، نقش دارند. هدف از اين مطالعه، كلونينگ و بررسي بيان اين پروتيين در باكتري E.Coli مي باشد. روش كار: در اين مطالعه تجربي توالي cDNA مربوط به پپتيد بالغ پروتيين مورفوژنتيك انساني2 (BMP-2) در باكتري E.Coli كلون شد. پلاسميد نوتركيب pET28a/BMP-2 پس از توالي يابي به باكتري بياني E.coli BL21(DE3) ترانسفرم گرديد. باكتري نوتركيب در محيط LB مايع حاوي آنتي بيوتيك كانامايسين در دماي C°37 كشت داده شد. القا با IPTG صورت گرفت. بررسي بيان به كمك RT-PCR و SDS-PAGE و تاييد بيان با وسترن بلاتينگ انجام شد. نتايج: توالي ژني به كمك PCR تكثير يافت. بعد از آماده سازي ژن و پلاسميد، واكنش اتصال صورت گرفت. توالي يابي، صحت كلونينگ را نشان داد. بررسي بيان با RT-PCR و SDS-PAGE نشان دهنده بيان پروتيين بود. وسترن بلاتينگ نتايج را تاييد كرد. نتيجه نهايي: بيان بالاي پروتيين نوتركيب در سيستم پروكاريوتي حاصل شد. استفاده از غلظت هاي متفاوت القا كننده در ساعت هاي مختلف نشان داد كه 4 ساعت بعد از القا با غلظت 1mM از IPTG، بيشترين بيان را داريم.

Introduction & Objective: Bone morphogenetic proteins are a group of cytokines that belongs to superfamily TGFB. These proteins play an important role in evolution of many of organs and tissues through germinal period followed by amending and rebuilding of bone tissue and car-tilage. The aim of this study was to clone and expression analysis of BMP-2 gene in E. coli bacteria. Materials & Methods: In this experimental study the sequence of cDNA related to the mature peptide of human morphogenetic protein-2 (BMP-2) in E.coli was synthesized and cloned in a PET system. After sequencing, recombinant plasmid pET28a/BMP-2 was transformed into the expression host, E.coli BL21 (DE3). The transformed bacteria were cultured in LB me-dium containing kanamaycin antibiotic at 37° C for O/N. Then, induction with IPTG took place. The expression was evaluated by reverse transcriptase PCR and SDS-PAGE followed by western blotting to confirm its identity. The observed band on SDS-PSGE showed the presence of the expressed protein at the 14k Dalton segment which was confirmed by west-ern blotting technique. Results: The gene sequence was amplified by PCR. After gene and plasmid preparation, lega-tion was performed. Sequencing confirmed accuracy of cloning. Protein expression was demonstrated by RT-PCR and SDS-PAGE. Results were confirmed by western blotting. Conclusion: In this study over-expression of this recombinant protein was achieved in a pro-karyotic system. Different concentrations of inducer were applied and harvesting was per-formed in different times after induction. The best expression was detected in 4 hours after induction with a concentration of 1mM IPTG. (Sci J Hamadan Univ Med Sci 2014; 21 (3): 196-202)