بيان و تخليص دو پروتيين نوتركيب DnaK و Omp31 بروسلا ملي تنسيس و جداسازي اندوتوكسين همراه آن‌ها

Expression, Purfication and endotoxin removal of Brucella melitensis DnaK and Omp31 proteins

زمينه: امروزه به‌دليل مشكلاتي كه سوش واكسن بروسلا ملي تنسيس ايجاد مي‌كند، توسعه واكسن ساب يونيتي با استفاده از پروتيين‌هاي نوتركيب مد نظر است. علي‌رغم به‌دست آمدن پروتيين‌هاي نوتركيب با بيش‌تر از 95 درصد خلوص، اين پروتيين‌ها هنوز حاوي ميزان زياد و مشخصي از اندوتوكسين هستند. اندوتوكسين‌ها، ليپوپلي‌ساكاريدهايي همراه با غشا بيروني باكتري‌هاي گرم منفي هستند. سميت ذاتي اين ليپوپلي ساكاريدها داراي يك اثري شاخص بر روي رخدادهاي بيوشيميايي بعضي از سلول‌ها از جمله سلول‌هاي ايمني هستند و مي‎توانند در آزمايش‌هاي انجام شده در شرايط آزمايشگاه تداخل ايجاد كنند. مواد و روش‌ها: پلاسميدهاي بياني حاوي دوژن dnakوomp31 به‌درون باكتري (DE3)E.coli Bl21 ترانسفورم شد. بعد پس از انتخاب كلوني مناسب با استفاده از روش وسترن بلات محلوليت و عدم محلوليت هر كدام معين شد. سپس بعد از بيان در 20 درجه به‌مدت 22 ساعت با استفاده از روش Ni-NTA آگاروز و روش تخليص با استفاده از اوره، پروتيين‌هاي نوتركيب تخليص گرديد. در هنگام شستشو Ni-NTA agarose هم از روش همراه با دترجنت Triton X-114 و هم بدون آن (استاندارد) استفاده شد. يافته‌ها: در اين مطالعه ميزان 20 و 8 ميلي‌گرم از پروتيين‌هاي نوتركيب DnaK و Omp31 به‌ترتيب با استفاده از روش استاندارد به‌دست آمد در حالي‌كه در روشي كه دترجنت استفاده شده بود، اين ميزان 20 درصد افت داشت. اما در عوض ميزان اندوتوكسين در محصول نهايي به‌ميزان بسيار زيادي جدا شده بود و به كمتر از EU 05/0 ميلي‌گرم در ليتر رسيد. نتيجه‌گيري: روش به‌كار رفته در اين مطالعه مي‌تواند به‌عنوان روشي مناسب به‌منظور بيان، تخليص و جدا سازي از محصول پروتيين نوتركيب نهايي براي تمام پروتيين‌هاي با خصوصيات فيزيولوژيكي مشابه به‌كار رود.

Background: New strategies are needed to protect against Brucella melitensis infection. Subunit vaccines offer a promising approach because they can stimulate both cellular and humoral immunity, so high production of recombinant protein with less content of endotoxin is desired. In present study, we described a method for expression and purification of B.melitensis recombinant DnaK(rDnaK) and Omp31(rOmp31) proteins while less content of endotoxins were detected in final product. Material and Methods: Recombinant pET-dnak and pDEST-omp31 plasmids were transformed into competent expression host E.coli BL21 (DE3). After induction by IPTG, bacteria were grown at 20?C for 22h. Then recombinant proteins were purified by Ni-NTA Agarose. Purification was done while two methods using Triton X-114 in washing steps and standard protocol (without detergent) were used in parallel. Results: rDnak and rOmp31 were purified by using Urea. We could obtain 20 and 8 mg recombinant proteins from rDnak and rOmp31 from 1 liter medium, respectively. The amount of endotoxins in final products was less content of 0.05 EU/mg. Furthermore, recovery of protein was up to 80% as compared to the standard protocol. Conclusion: The method used in this study, gives a product with very low extent of endotoxin, but 20% of recombinant proteins were lost. So we think the method described here can be used for purification and endotoxin removal of other recombinant proteins with similar physiologic properties.