طراحي و ساخت DNA Ladder صد جفت بازي با روش تلفيقي PCR و هضم آنزيمي

Designing and constructing an 100 bp DNA Ladder by combining PCR and enzyme digestion methods

زمينه و هدف: ماركرهای DNA به‌عنوان يكی از ابزارهای بسيار ضروری در آزمايشگاه‌های بيولوژی مولكولی مطرح می‌باشند. از آن‌ها برای تخمين اندازه قطعات DNA مورد آزمايش، به‌واسطه مقايسه ميزان حركت الكتروفورتيك قطعه مجهول و ماركر پس از انجام الكتروفورز استفاده می‌گردد. امروزه روش‌های متنوعی برای توليد تجاری اين ماركرها به‌كار گرفته می‌شوند. در اين مطالعه روشی كارآمد برای توليد تجاری اين محصول ارايه گرديده است. روش‌ بررسی: در اين پژوهش برای دست‌يابی به قطعات با اندازه مورد نظر از تلفيق دو روش هضم آنزيمی و واكنش زنجيره‌ای پلی‌مراز بهره گرفته شد. در روند مبتنی بر هضم آنزيمی به طراحی و ساخت پلاسميدهايی پرداخته شد كه اندازه DNA تشكيل دهنده بدنه آن‌ها برابر با طول قطعه مورد نظر بوده و با خطی كردن پلاسميد، قطعه مربوطه توليد گرديد و در روش PCR در Multiple Cloning Site MCS پلاسميد pTZ57R قطعاتی با طول‌های مورد نظر قرار داده شد و از آن‌ها به‌عنوان الگو برای توليد نهايی اين قطعات در واكنش PCR استفاده گرديد. يافته‌ها: با استفاده از اين استراتژی قطعات 2000 و 3000 جفت بازی به‌واسطه هضم آنزيمی پلاسميدهايی با همين اندازه توليد شد و قطعات 100 تا 1500 جفت بازی، طی واكنش PCR و تنها با استفاده از يك جفت پرايمر جلوبر و معكوس مكمل بدنه پلاسميد در دو طرف Multiple cloning site پلاسميد pTZ57R حاصل گرديد. نتيجه‌گيری: مزيت اين روش استفاده از يك جفت پرايمر برای توليد تمام قطعات با روش PCR و استفاده از آنزيم‌های ارزان قيمت در تهيه قطعات بزرگ می‌باشد.

Background: Molecular DNA markers are one of the most important tools in molecular biology labs. The size of DNA molecules is determined by comparing them with known bands of markers during gel electrophoresis. There are many different protocols to produce these kinds of molecular markers. In this study we have suggested an efficient strategy to produce molecular weight markers in industrial proportions. Methods: To achieve the desired sizes of DNA fragments, a combination of two previously known methods, restriction enzyme digestion and polymerase chain reaction (PCR), were used. The enzymatic digestion process was based on designing and constructing plasmids which equaled in size with the desired length of DNA fragments and produced the desired DNA fragment upon linearization. In the PCR method, the desired length of DNA fragments were cloned in multiple cloning sites of pTZ57R plasmid and in a PCR reaction, the new constructed plasmid was used as a template to produce the final fragment. Results: Upon application of this strategy, 2000 and 3000 bp DNA fragments were produced by enzymatic digestion of plasmids of the same size. Moreover, 100 to 1500 bp fragments were produced during PCR using only a set of forward and reverse primers at the flanking region of pTZ57R multiple cloning site. Conclusion: The highest advantage of this cost-benefit approach is to produce different types of molecular weight markers by using an effective and short protocol