آميزه مناسبي از اكتينيدين ميوه كيوي و تريپسين براي جداسازي و كشت سلول‌هاي اندوتليال آئورت موش صحرايي

An optimized mixture of kiwifruit actinidin and trypsin for isolation and culture of endothelial cells from rat aorta

زمينه و هدف: آنزيم‌های پروتئوليتيك، خصوصاً كلاژنازها برای هضم ماتريكس خارج سلولی، جداسازی سلول‌ها و كشت اوليه مورد استفاده قرار می‌گيرند. با توجه به مشكلات تخليص و مقدار كم كلاژنازها در منابع باكتريايی يا جانوری، يافتن منابع جديد و كم هزينه اين آنزيم‌ها اهميت دارد. به‌همين جهت در اين مطالعه اكتينيدين كه فراوان‌ترين پروتيين ميوه كيوی است، تخليص شد و مخلوط مناسبی از آن و تريپسين برای جداسازی سلول‌های اندوتليال آئورت موش صحرايی به‌كار رفت. روش بررسی: سلول‌های اندوتليال آئورت با استفاده از محلول هضمی شامل غلظت‌های متفاوت اكتينيدين (دو تا 16 ميلی‌گرم در ميلی‌ليتر) و تريپسين (3/0، 6/0، 2/1 و 4/2 ميلی‌گرم در ميلی‌ليتر) در زمان‌های مختلف (15 تا 90 دقيقه) جدا شدند و در محيط كشت DMEM كشت داده شدند. سلول‌های جداشده به‌واسطه خصوصيات مورفولوژيك و رنگ‌آميزی ايمونوسيتوشيمی شناسايی شدند و درصد بقا به‌كمك آزمون تريپان بلو تخمين زده شد. يافته‌ها: اكتينيدين در غلظت 10 ميلی‌گرم در ميلی‌ليتر به‌همراه تريپسين با غلظت 2/1 ميلی‌گرم در ميلی‌ليتر به‌مدت 60 دقيقه توانست سلول‌های اندوتليال آئورت موش صحرايی را جدا كند. درصد بقای سلول‌های ذكر شده در اين شرايط 90% تخمين زده شد. خصوصيات مورفولوژيك و ايمونوسيتوشيمی ماهيت سلول‌های جدا شده به‌عنوان سلول‌های اندوتليال را تأييد نمود. نتيجه‌گيری: يافته‌ها نشان داد كه مخلوط بهينه اكتينيدين و تريپسين اثرات سمی محسوسی بر سلول‌های جدا شده نداشته و گزينه‌ای مناسب و جديد برای جداسازی سلول‌های اندوتليال آئورت موش صحرايی است.

Background: Proteolytic enzymes, especially collagenases, are used for digestion of extracellular matrix, cell isolation and primary culture. Because of the problems in purification and low amount of collagenases in bacterial or animal sources, it is important to find new sources of the enzymes. So, in the present study actinidin, a plentiful protein in kiwifruit was purified and a mixture of actinidin and trypsin was applied to isolate rat aortic endothelial cells. Methods: Aortic endothelial cells were isolated using digestion solution containing different concentrations of actinidin (from 2 to 16 mg/ml) and trypsin (0.3, 0.6, 1.2 and 2.4 mg/ml) in different times (from 15 to 90 minute). Isolated cells were cultured in DMEM culture medium. Isolated cells were identified by morphological characteristics and immunocytochemical staining; viability of separated cells was estimated by trypan blue exclusion test. Results: Actinidin in concentration of 10 mg/ml with trypsin in concentration of 1.2 mg/ml for one hour could isolate rat aortic endothelial cells. In this condition the viability of cells was estimated 90%. Morphological and immunocytochemical charac- teristics confirmed the isolated cells as endothelial cells. Conclusion: The results showed that the mentioned mixture of actinidin and trypsin has not considerable toxic effects on separated cells and is a novel and suitable option for isolation of rat aortic endothelial cells