بهينه‌سازي توليد فعال‌كننده پلاسمينوژن بافتي نوتركيب در انگل ليشمانياي غير بيماري‌زا با طراحي دو سازۀ ژني

Optimizing production of recombinant tissue plasminogen activator in non-pathogenic Leishmania by two genetic constructs

زمينه و هدف: پروتيين فعال‌كننده پلاسمينوژن بافتی نوتركيب (rt-PA) يكي از مهم‌ترين تركيبات ضد لخته می‌باشد كه در درمان سكته‌های قلبی و مغزی از اهميت بالايی برخوردار است. تاكنون روش‌های مختلفی براي توليد پروتيين‌های نوتركيب هترولوگ با استفاده از ميزبان‌های پروكاريوتيك و يوكاريوتيك مورد بررسی قرار گرفته است. اخيراً انگل ليشمانيا تارنتولا Leishmania tarentolae (L. tarentolae) به دلايل متعددی از جمله عدم بيماری‌زايی و شرايط ويژه آن در توليد پروتيين‌های پيچيده اهميت زيادی يافته است. روش بررسی: در تحقيق حاضر به‌منظور بهينه‌سازی ميزان بيان t-PA نوتركيب انسانی با استفاده از سلول L. tarentolae دو سازه بيانی كه هر يك حاوی دو كپی از cDNA t-PA بود طراحی و ساخته شد. اين سازه‌ها از طريق الكتروپوريشن به سلول‌های L .tarentolae وارد و در ژنوم انگل ادغام گرديدند. پس از انتخاب كلون‌های ترانسفورم شده، بيان t-PA ترشح شده به محيط كشت سلولی و ميزان فعاليت بيولوژيكی آن توسط آزمون‌های وسترن بلات و كروموليز (Chromolize) بررسی گرديد.  يافته‌ها: ظهور باند kD64 در غشاء نيتروسلولز حضور t-PA در محيط كشت سلول‌های L. tarentolae ترانسفكت شده را تاييد كرد. نتايج آزمون علاوه بر تاييد حضور پروتيين t-PA فعال در سوپ سلولی نشان داد كه ميزان فعاليت پروتيين ترشح شده در سلول‌های ترانسفكت شده با يك سازه، IU/ml375 و در سلول‌های ترانسفكت شده با هر دو سازه برابر با IU/ml480 می‌باشد.  نتيجه‌گيری: در اين مطالعه ميزان فعاليت t-PA بيان شده در محيط كشت سلول‌های ترانسفكت شده، دست‌كم هفت برابر بيشتر از مقدار گزارش شده در مطالعات پيشين در اين ميزبان و نيز بيشتر از عدد گزارش شده در بسياری از ميزبان‌های يوكاريوتيك ديگر می‌باشد.

Background: Recombinant tissue plasminogen activator (rt-PA) is one of the most important thrombolytic agentsused in patients with vascular occlusions such as acute ischemic stroke or myocardial infarction. A variety of recombinant protein expression systems have been developed for heterologous gene expression in prokaryotic and eukaryotic hosts. In recent years, Leishmania tarentolae (L. tarentolae), a non-pathogenic trypanosomatid protozoa, has come under consideration because of its safety and immunogenicity as a vaccine vector and special attributes in the expression of complex proteins. This study was done to improve rt-PA expression in this protozoon and create the opportunity for the replacement of rt-PA gene with other genes for the production of other complex proteins. Methods: Two expression cassettes were used for the integration of two copies of t-PA cDNA, one copy in each cassette, into the parasite genome by electroporation. The transformed clones were selected by antibiotic resistancy. The expression of active secreted rt-PA was confirmed by Western blot analysis and Chromolize assay. Results: Appearance of a 64 kD band in nitrocellulose membrane in the Western blot analysis confirmed the presence of full-length rt-PA in the culture media. Chromolize assay showed the expression levels of active recombinant t-PA in single and double transfected L. tarentolae clones- 375 IU/ml and 480 IU/ml of the culture media,respectively. Conclusion: The produced rt-PA in the culture media containing the transfected cells was at least seven times higher than what has been reported in previous studies on L. tarentolae or on some other eukaryotic systems.