بيان و خالص‌سازي ژن نوتركيب Cold sensitive Taq DNA polymerase در E.coli

Expression and the purification of the Cold sensitive Taq DNA polymerase recombinant gene in E.coli

سابقه و هدف: آنزيم DNA پليمراز مقاوم به حرارت بعلت كاربرد آن در PCR و تحقيقات بيولوژي مولكولي توجه زيادي را به خود معطوف ساخته ‌است و در نتيجه اهميت مطالعه روي DNA پليمرازهاي مقاوم به حرارت مختلف را دو چندان نموده‌ است. هدف از اين مطالعه سنجش عملكرد و ميزان توليد آنزيم DNA پليمراز حساس به سرما و مقاوم به حرارت توليد شده در ميزبان باكتريايي و خالص‌سازي سريع و ارزان آن مي‌باشد. مواد و روش‌ها: بعد از سنتز ژن طراحي شده به صورت مصنوعي، كلونينگ آن به داخل وكتور pET28a انجام شد. سپس پلاسميد حاوي ژن توليدكننده آنزيم Taq DNA polymerase به سويه E.coli BL21 انتقال يافت. در اين مطالعه از IPTG به عنوان القا گر براي بيان ژن موردنظر استفاده شد. خالص‌سازي اوليه آنزيم توسط امواج اولتراسوند و در ادامه به وسيله شوك حرارتي در 72 درجه سانتي‌گراد و رسوب‌دهي ساير پروتيين‌هاي نامحلول به وسيله سانتريفوژ انجام گرديد. فعاليت و عملكرد Taq DNA polymerase توليد شده در مقايسه با آنزيم تجاري مورد بررسي قرار گرفت. يافته‌ها: Taq DNA polymerase مقاوم به حرارت و حساس به سرماي نوتركيب بيان شده در E.coli، برتري قابل توجه و عملكرد بهتري نسبت به آنزيم تجاري از نظر فعاليت و مقاومت در برابر حرارت نشان داده است. نتيجه‌گيري: با توجه به اهميت و سطح كاربرد آنزيم Taq DNA polymerase مقاوم به حرارت در مطالعات زيست‌شناسي مولكولي، روش مورد استفاده در توليد اين آنزيم، روشي كاربردي و مقرون به صرفه مي‌باشد. به علاوه، سهولت روش به كار گرفته شده و نيز صحت و دقت عمل آنزيم توليد شده، دليل مناسب و قابل قبولي براي توليد آزمايشگاهي و محلي آنزيم cold sensitive Taq DNA polymerase با خلوص بالا مي‌باشد.

Aim and Background: Thermostable DNA polymerase enzyme has been taken much into consideration due to its application in PCR and molecular biology researches and it has doubled the importance of the study on the various thermostable DNA polymerase. The purpose of this study was to assay the function and efficient production of the cold sensitive thermostable DNA polymerase and its quick and cheap purification. Material and Methods: After synthesis of the designed gene artificially, it was cloned into the pET28 vector and then was transferred into E.coli. IPTG was used as an inducer in the study of gene expression. Initial purification of the enzyme was performed by heat treatment at 72 °C and precipitation of other insoluble proteins by centrifuge. The DNA synthesis activity of crude extract was compared with commercial enzyme. Result: Recombinant cold sensitive and thermostable Taq DNA polymerase expressed in E.coli showed a significant advantage and more desirable functionality such as activity and thermostable compared to commercial enzyme. Conclusion: With regard to importance and application level of thermostable DNA polymerase in molecular biology, the production method used in this study is practical and cost effective. Additionally, the simplicity of producing method of this enzyme and its accuracy is a good reason for artificial and local production of highly pure cold sensitive Taq DNA polymerase.