بررسي اثر يك مشتق از پروتيين Apaf-1 بر فعاليت كاسپاز سلول‎هاي HEK293T

Investigation the Effect of an Apaf-1 Derivative on Caspase Activity in HEK293T Cells

مقدمه: مرگ برنامه‌ريزي شده سلول يا همان آپوپتوز يكي از مهمترين فرآيندهاي فيزيولوژيكي در تكوين و حفظ هموستازي موجودات چندسلولي مي‌باشد. هر گونه اختلالي در تنظيم آپوپتوز منجر به ايجاد اختلالات گسترده ژنتيكي، بيماريهاي خود ايمني و سرطان مي‌شود. فرآيند آپوپتوز هم در بحث سلامت و هم در بيماريها ضروري مي‌باشد. اصطلاح آپوپتوز به تغييرات مورفولوژيكي يك سلول كه درگير مرگ برنامه‌ريزي شده باشد اطلاق مي‌گردد كه اين تغييرات معمولاً به صورت چروكيدگي سلول، متراكم شدن هسته، برآمدگي‌هاي سطح غشا ، قطعه قطعه شدن غشا پلاسمايي و تبديل شدن آنها به اجسامي به نام اجسام آپوپتوزي و تغييرات سطح غشا كه در نهايت به فاگوسيتوز شدن سلول آپوپتوزي منجر مي‌شود. مواد و روشها: پس از ايجاد جهش هدف دار در ژنApaf-1 به كمكPCR ، سلول‎هاي HEK293T به كمك ليپوفكتامين ترانسفكت شدند. 24 ساعت بعد از ترانسفكشن سلول ها در حضور دوكسوروبيسين قرار گرفتند و فعاليت كاسپاز 3 و 7 آن ها در زمان هاي مختلف مورد سنجش قرار گرفت. يافتهها: فعاليت كاسپاز 3 و 7 به خوبي در سلول‎هاي ترانسفكت شده مشاهده شد و اين فعاليت حدود 3 برابر سلول‎هاي كنترل بود كه اين داده به خوبي نشان دهنده افزايش فعاليت كاسپاز 3 و 7 در سلول‎هايHEK293T است. با توجه به مشاهده صورت گرفته احتمالاً دومين انتهايي پروتيين Apaf-1 نقش كنترلي بر روي آزادسازي كاسپاز دارد. نتيجه‎گيري: نتايج اين پژوهش نشان داد دومين انتهايي پروتيينApaf-1 فعاليت كاسپازهاي سلول را كنترل مي‎كند و امكان استفاده از آن به عنوان يك بيوسنسور براي غربالگري داروهاي ضد سرطان وجود دارد.

Background: Programmed cell death or apoptosis is one of the most important physiological processes involved in development and homeostasis maintenance of multicellular organisms. Every defect in apoptosis regulation leads to wide variety of genetic disorders, autoimmune diseases and cancers. Apoptosis is an essential process in both health and diseases. Apoptosis is defined as morphological changes in a cell undergoing programmed cell death. These changes lead to cell shrinkage, nuclear condensation, membrane intrusion, plasma membrane fractionation and their conversion to apoptotic bodies and changes in cell surface membrane which cause phagocytosis of the cell bearing apoptosis. Materials and Methods: Apaf-1 gene is mutated using PCR and then transfected into HEK293T cells by lipofectamin. 24 h transfected cells exposed to doxorubicin and caspase 3/7 activity was measured over different times. Result: Caspase 3/7 activity was observed obviousely in transfected cells, which was 3 fold greater than those of controls. This data demonstrates the increase in caspase 3/7 activity in HEK293T cells. Based on our observation, the terminus domain in Apaf-1 is probably play a role in releasing the caspases. Conclusion: The results of this study indicated that terminal domain of Apaf-1 has pivotal role in caspase regulation and it is possible to design a biosensor for screening the anticancer drugs by removing terminal domain of this protein.