بررسي مولكولي ژن luxA براي شناسايي باكتري‌هاي نورافشان درياي مازندران

Molecular investigation of luxA gene to identify luminescent bacteria in Caspian sea

نورتابي زيستي (بيولومينانس) واكنشي شيميايي است كه سبب نشر نور در موجودات زنده مي‌گردد. باكتري‌هاي نورافشان، فراوان‌ترين موجودات نورافشان در طبيعت هستند. براي شناسايي اين باكتري‌ها از آزمون‌هاي بيوشيميايي استفاده مي‌شود. بررسي مولكولي ژن luxA كه توالي‌ آن در باكتري‌هاي نورافشان متفاوت است، مي‌تواند در تشخيص اين باكتري‌ها مناسب باشد. در پژوهش حاضر، نتايج تعيين جنس باكتري‌هاي نورافشان بر اساس آزمون‌هاي بيوشيميايي و نتايج حاصل از واكنش زنجيره‌اي پليمراز با استفاده از پرايمر‌هاي اختصاصي luxA مقايسه شد. همچنين، نتايج توالي‌يابي ژن 16S rDNA جدايه‌هاي نورافشان براي تاييد نتايج، بررسي شد. نمونه‌هاي آب درياي مازندران از ايستگاه‌هاي متعدد سواحل جنوبي جمع‌آوري شد. باكتري‌هاي نورافشان با استفاده از محيط‌هاي كشت اختصاصي SWB و SWA جداسازي و ويژگي‌هاي مورفولوژيكي و فيزيولوژيكي آنها تعيين گرديد. پس از گروه‌بندي جنس‌هاي مختلف باكتري‌هاي نورافشان بر اساس توالي ژن luxA، پرايمرهاي اختصاصي طراحي و سنتز شد. با استخراج نوكلييك‌اسيد باكتري‌ها، واكنش زنجيره‌اي پليمراز ژن‌هاي luxA و 16S rDNA انجام شد. پس از تعيين توالي ژن 16S rDNA جدايه‌هاي باكتري، درخت فيلوژني نيز رسم شد. تعداد 9 جدايه‌ باكتريايي نورافشان از آب درياي مازندران جداسازي شد. بر اساس نتايج آزمون‌هاي بيوشيميايي، تعداد پنج جدايه به جنس Photobacterium و چهار جدايه به جنس Vibrio متعلق بود. همچنين، واكنش زنجيره‌اي پليمراز ژن luxA جنس‌هاي Aliivibrio، Photobacterium و Vibrio به ترتيب با پرايمر‌هاي اختصاصي luxA1، luxA2 و luxA3 انجام شد. نتايج توالي‌يابي ژن 16S rDNA جنس Photobacterium، نشان‌دهنده شباهت بيش از 99 درصد اين جدايه‌ها به گونه‌ P. leiognathi بود. نتايج تعيين جنس بر اساس آزمون‌هاي بيوشيميايي و بررسي مولكولي واكنش زنجيره‌اي پليمراز با پرايمر‌هاي اختصاصي luxA و نيز نتايج حاصل از توالي‌يابي ژن 16S rDNA، با يكديگر مطابقت داشت. بنابراين، پرايمر‌هاي اختصاصي ژن luxA مي‌تواند براي تعيين اوليه جنس باكتري‌هاي نورافشان به كار رود.

Abstract Bioluminescence is a chemical reaction that causes light emission in the living organisms. Luminous bacteria are the most abundant bioluminescent organisms in natural environments. Biochemical tests are used for identification of luminous bacteria. However, molecular characterization of luxA gene could be suitable for investigation of luminescent bacteria due to differences in the sequences. In this study, the results of identification of luminescent bacteria were compared to the results of biochemical tests and PCR amplification of luxA using designed specific primers. In addition, thr results were confirmed by sequencing of 16S rDNA gene in the isolated luminescent bacteria. Samples of sea water were collected from several locations of southern shores of the Caspian sea. Luminous bacteria were isolated using specific cultures SWB and SWA. Then, morphological and physiological characterization of the isolates was identified. Specific primers for amplification of luxA were designed and synthesized after classification of luminescent bacteria according to the sequence of luxA. Polymerase chain reaction for luxA and 16S rDNA genes was performed after nucleic acid extraction of bacteria. Sequencing of 16S rDNA gene was obtained and then phylogenetic tree was constructed. Nine strains of luminescent bacteria were isolated from the Caspian sea. According to the results of biochemical tests, 5 strains belonged to the Photobacterium genus and 4 strains belonged to the Vibrio genus. Also, luxA PCR amplification of Aliivibrio, Photobacterium and Vibrio was done in order to specify primers luxA1, luxA2 and luxA3, respectively. In addition, BLAST subroutine of the 16S rDNA sequences revealed that the isolates were most similar to Photobacterium leiognathi with 99% homology. Results of isolates determination are according to the biochemical tests, molecular investigation of PCR luxA using specific primer and 16S rDNA analyses was correspondent. Therefore, the specific primer of luxA could be used for preliminary determination of luminescent bacteria. Key words: Luminous bacteria, Bioluminescence, Caspian sea, luxA