ساخت ناقل بياني pGCGi حاوي ژن GUS اينترون‌دار و تاييد آن با روش‌هاي ريزپرتابي و تزريق اگروباكتريوم

Construction of pGCGi, an expression vector carries intron containing GUS and analysis using micro-bombardment and agroinjection

بيان موقت يك روش سريع و آسان در آناليز بيان پروموتر است. اين روش تحت تاثير موقعيت ورود تراژن در ژنوم واقع نمي‌شود، زيرا اين نكته مي‌تواند بيان تراژن را در روش انتقال دايمي تحت تاثير قرار دهد. بيان موقت از راه‌هاي مختلف نظير: اگرواينفيلتراسيون، ريزپرتابي و وكتورهاي ويروسي قابل انجام است. بيان موقت مبتني بر اگروباكتريوم كارآيي بالا و قابل قبول در آناليز بيان تراژن، خاموشي ژن، برهمكنش پاتوژن-ميزبان، پروتيين-پروتيين‌ها، توالي‌هاي تنظيمي-عوامل نسخه‌برداري استفاده شده است. به منظور آناليز عناصر تنظيمي يك وكتور حامل، يك ژن گزارشگر تحت كنترل يك پروموتر رايج مورد نياز است تا براي استاندارد نمودن سطح بيان مورد استفاده قرار گيرد. پژوهش حاضر، با هدف ساخت يك وكتور شاهد بر اساس توالي دو وكتور والدي به نام‌هاي pGPTV و pCAMBIA3301 طراحي و انجام شده است. وكتور ساخته شده به نام pGCGi داراي يك ژن گزارشگر GUS اينترون‌دار است كه تحت كنترل پروموتر CaMV 35S قرار گرفته است. سنجش فعاليت آنزيم بتاگلوكورونيداز در سلول‌هاي اگروباكتريوم عدم بيان پروكاريوتي ژن گزارشگر را تاييد نمود. آناليز عملكرد وكتور pGCGi با استفاده از روش تزريق اگروباكتريوم و ريزپرتابي در برگ توتون و بافت اپيدرم پياز انجام شد. نتايج سنجش هيستوشيميايي GUS نشان داد كه وكتور pGCGi قادر است ژن گزارشگر را در سلول‌هاي گياهي بيان نمايد و مي‌توان از آن به عنوان شاهد در آزمايش‌هاي بيان موقت استفاده نمود.

Transient gene expression is fast, easy and not influenced by positional effects that potentially affect on gene expression levels in stable gene transformation. Transient expression can be applicable using agroinfilteration, biolistic and viral vectors. Agrobacterium mediated transient expression have been shown as an efficient and versatile method for analyzing transgene expression, gene scilencing, host-pathogen interactions, protein-protein interaction, and cis-element/transfactor interaction. A control vector consists of an interon containing reporter gene under control of a common promoter is often required for Cis-acting elemen analysis to standardize the variation. This study was carried out to construct a control vector based on two parental binary vectors, pGPTV and pCAMBIA3301. The constructed vector, pGCGi had an interon containing GUS reporter gene under control of the full sequence of CaMV 35S promoter. The GUS staining results revealed that the GUS intron containg gene cannot produce an active B- glucronidase enzyme in agrobacterial cells. The functional gene expression analysis of the new vector was done using agroinjection and prticle delivery system in tobacco and onion eoidermal cells respectively. The histochemical GUS staining results showed pGCGi could express the reporter gene in plant cells and culd be used as control vector in transient expression experiments.