مهار مسير TGF-b به‌وسيله تكنيك RNAi در سلول‌هاي بنيادي خون‌ساز كشت داده شده روي داربست سه بعدي DBM

TGF-b downregulation by RNAi technique in ex vivo-expanded HSCs on 3D DBM scaffold

زمينه و هدف: خون بندناف در پيوند مغز استخوان، به‌علت دوز پايين سلول‌های CD34+ دارای محدوديت‌هايی است كه می‌بايست اين سلول‌ها مورد تزايد قرار گيرند. تكثير سلول‌های بنيادی با استفاده از افزايش فعاليت خود تكثيری آن‌ها در شرايط آزمايشگاهی روی داربست DBM (ماتريكس استخوانی معدنی‌زدا شده) پوشيده شده با سلول‌های پروژنيتور مزانشيمی يعنی سلول‌های بنيادی سوماتيك غير محدود شده (USSC) پيشنهاد می‌شود. مسير TGF-b از عوامل مهم مهاری برای فعاليت خود تجديد شوندگی سلول‌های بنيادی است كه در اين تحقيق از هم‌زماني كشت برون تن (Ex vivo) و مهار مسير TGF-b با كمك تكنيك RNAi استفاده شد. روش بررسی: سلول‌های USSC، از خون بندناف جدا شده و سپس روی داربست DBM و هم كف پليت، به عنوان لايه مغذی، پوشش داده شدند. سلول‌های CD34+ با روش Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) از جفت انسانی تخليص و در شرايط دو بعدی و سه بعدی هم كشتی، با siRNA عليه TGFbR2 تيمار شدند. ميزان سركوب بيان ژن مربوطه باReal-Time PCR  كمی بررسی شدند. در نهايت شمارش سلولی، فلوسايتومتری و فعاليت كلنی‌زايی سلول‌ها مورد ارزيابی قرار گرفت. يافته‌ها: كشت سه بعدی به‌همراه مهار ژن TGFbR2 موجب افزايش قابل توجه 7/0±41 برابر سلول‌های CD34+ شد. ولي افزايش نسبت تزايد در دو بعدی ساده بيش از سه بعدی بود و نيز بيش‌ترين مهار بيان ژن، بيش‌ترين افزايش در ماركر سطحی با آناليز فلوسايتومتری در حالت كشت دو بعدي ساده نشان داده شد (05/0P<). نتيجه‌گيری: بنابراين از نظر موثر بودن سيستم انتقال RNAi، كشت دو بعدی ساده نسبت به سه بعدی كارآمدتر بود به‌طوری كه سلول‌ها آزادی كم‌تر داشته و بيش‌تر با سلول‌های لايه مغذی درگير بودند.

Background: Bone Marrow Transplantations (BMT) are limited by low CD34+ cell counts in umbilical cord blood (UCB) and these cells need to be expanded for success in such procedures. To achieve this goal, ex vivo expansion of hematopoietic stem cells (HSCs) by enhancing their self-renewal activity on demineralized bone matrix (DBM) scaffold coated with mesenchymal progenitor cells (MPCs) and unrestricted somatic stem cells (USSCs) was recommended. TGF-b pathway is a key inhibitory factor for HSCs self-renewal. In this study ex vivo expansion and downregulation of TGF-b pathway were simultaneously performed. Methods: USSC cells were isolated from UCB and then coated on DBM scaffold as a feeder layer. UCB CD34+ cells were isolated from UCB by magnetic activated cell sorting (MACS) method and were transfected by siRNA against TGFbR2 in two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cultures by co-cultivation with USSC. TGFbR2 expression levels were evaluated by quantitative real-time PCR. Cell count and flow cytometry were performed and clonogenic activity was evaluated. Results: Ex vivo expansion of CD34+ cells was significantly enhanced (41±0.7 folds) by TGFbR2 downregulation, especially in 2D than 3D cultures. Finally, 2D culture showed less TGFbR2 expression levels and higher increase in the percentage of CD34 markers by flow cytometry assay. Conclusion: The 3D siRNA delivery system would be of lower efficiency in contrast to 2D settings where the cells have less freedom and are in more contact with the feeder layer.