تهيه پودر ماتريكس خارج سلولي از بافت چربي جهت مهندسي بافت

Production of extracellular matrix powder for tissue engineering

زمينه و هدف: به‌تازگی داربست‌های تهيه شده از بافت‌های زنده، به‌عنوان بستر رشد و تكثير سلول بنيادی مورد توجه رشته پزشكی ترميمی و مهندسی بافت قرار گرفته‌اند. مواد زيستی طبيعی به روشی نياز دارند تا آنها را از تجزيه حفظ كرده، ايمنی‌زايی را كاهش داده و بافت را استريليزه كند. هدف اين مطالعه تهيه داربست از بافت چربی انسانی و بررسی ساختار پروتيينی پودر سلول‌زدايی شده حاصل از آن است. روش بررسی: اين مطالعه از نوع توليد مواد و بررسی تحليلی روش‌ها است. بافت چربی مورد نياز از مواد زايد حاصل جراحی ليپوساكشن و با كسب رضايت شفاهی بيماران تامين گرديد. جراحی زيبايی مربوط به نواحی پهلو و شكم خانم‌های در رده سنی 42-38 ساله در يك كلينيك خصوصی طی زمستان 1391 تا بهار 1392 انجام شد. جهت تهيه داربست مناسب، سلول‌زدايی بافت چربی انسان با استفاده از روش‌های فيزيكی، شيميايی و هضم آنزيمی انجام گرديد. نمونه داربست حاصله تحت بررسی ميكروسكوپ الكترونی و بررسی تحليلی توسط ژل الكتروفورزيس با تكنيك (Blue-Native) و بيان ژن‌های لامينين، فيبرونكتين، كلاژن تيپ 1، كلاژن تيپ 4، دسمين، اكتين، اينتگرين، به روشReal Time- Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) قرار گرفت. يافته‌ها: تقريبا از هر ml 200 بافت چربی mg 10 ماتريكس به‌دست آمد. فقدان سلول و ماهيت پروتيينی (به‌طور عمده كلاژن نوع يك و چهار، فيبرونكتين و لامينين) پودر ماتريكس حاصله، با رنگ‌آميزی ايمينوهيستوشيمی، بررسی ژنتيك و كروماتوگرافی تاييد شد. مشاهدات ميكروسكوپ الكترونی خصوصيات ساختمانی سه بعدی مناسب داربست از جمله مشخصه متخلخل نمونه‌ها را مشخص نمود. نتيجه‌گيری: ارزيابی تحليلی و مقايسه‌ای بيان پروتيين‌های اختصاصی نشان داد كه پودر ماتريكس تهيه شده از بافت چربی در اين مطالعه علی‌رغم به‌كارگيری روش‌های هضم آنزيمی غنی از تركيبات كلاژن و دارای توانايی عملكرد ترميمی و ساختاری است و به‌ويژه می‌تواند فرصت جديدی برای پيشرفت روش‌های ترميم بافت نرم ايجاد كند.

Background: With the aim of regenerating healthy tissues, different tissue engineering strategies pointed to extracellular matrix (ECM)-based scaffolds in tissue engineering and regenerative medicine and wound healing. It is a multidisciplinary science works to create biocompatible scaffolds with perfect physical parameters, mechanical integrity and high porosity to promote cell growth, migration and angiogenesis. With the increased incidence of obesity, subcutaneous adipose tissue is abundant and readily accessible. Liposuction surgeries yield from 100 mL to 3 L of lipoaspirate tissue. We present our prepared acellular ECM powders derived from human adipose tissue obtained from lipoaspirate, which contains large amounts of collagen suitable for induction of adipogenesis. Methods: The study had been carried out from December 2012 to March 2013 in Tissue Bank and Research Center in Imam Khomeini Hospital Tehran, Iran. Fresh human adipose tissue was obtained by liposuction of abdominal fat pad in a private Day Clinic. By using wasted material of liposuction, we obtained 100 to 200 cc fat tissue from each patient. After physical (freeze-thaw-slicing-manual massage) and chemical (enzymatic-detergent-acid digestion) treatment, an acellularized matrix was created from fat tissue. The final material lyophilized and ground to powder. We analyzed ultra structure and biochemical properties of obtained ECM powder by using electron microscopy, immunohistochemistry (IHC) examination and proteomic studies. Results: After mechanical and chemical process of decellularization, scanning electron micrographs of the samples showed smooth and contiguous collagenous components throughout the scaffold. IHC showed strong positive labeling for collagen IV and no evidence of nuclear material in the specimen. Separation of protein complex by Blue Native Polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) has proven type I collagen triple helices associate to form banded fibrils. RNA preparation and Gene Expression Analysis (RT-PCR) by using specific primers for laminin, fibronectin, collagen type I and IV, desmin, and actin showed strong staining of our fat tissue scaffold with collagen type I, fibronectin, collagen IV and laminin. Conclusion: The results show that our decellularization method produced an adipose ECM scaffold rich of collagen fibers, suitable and effective substrate for use in soft tissue engineering and regenerative medicine.