شناسايي، همسانه سازي، تعيين توالي ژن virG و ايجاد سويه بومي تخفيف حدت يافته Delta virG با استفاده از سيستم Landa Red recombinase

Identification, cloning, sequencing virG gene and construction a live Attenuated Delta virG(icsA) strain byusing Landa Red recombinase

باكتري شيگلا و سويه هاي اشرشيا كلي مهاجم روده اي (EIEC) جز خانواده با كتريهاي گرم منفي و عامل مسري ترين اسهال باسيلي (شيگلوز) مي باشند. ژن virG يكي از فاكتور هاي ضروري در آسيب زايي باكتري شيگلا است. پروتيين رمزگذاري شده توسط اين ژن، بر روي غشاي خارجي (OM) شيگلا قرار گرفته و به خانواده پروتيينهاي خود منتقل شونده AT (Autotrnasporter) خارج سلولي در باكتريهاي گرم منفي تعلق دارد. يكي از روشهاي ساخت واكسنهاي شيگلا ايجاد تخفيف حدت در سويه هاي وحشي از طريق جهش زايي در ژنهاي ويژه آسيب زايي باكتري مي باشد. هدف از اين مطالعه شناسايي، همسانه سازي و تعيين توالي ژن virG و ايجاد سويه زنده تخفيف حدت يافته virG Delta با استفاده از سيستم Landa Red recombinase در سويه شيگلا ديسانتري تيپ1 جدا شده از مبتلايان به شيگلوز بود. در ابتدا با استفاده از آزمايش سرم شناسي و واكنش زنجيره اي پليمراز (PCR)، گونه و سرووار شيگلاي جدا شده از بيمار مورد بررسي و تاييد قرار گرفت. با توجه به اطلاعات موجود در پايگاه داده هاي ژنومي (NCBI)، آغازگرهاي شناسايي ژن virG طراحي و پس از تكثير اين ژن، در حامل pGEM-7zf همسانه سازي و توالي يابي با استفاده از آغازگر هاي عمومي حامل انجام گرديد. سويه مذكور توسط پلاسميد كمكي pKD46 (حامل ژنهاي لازم براي القاي نوتركيبي تحت پروموتور آرابينوز) با روش شوك الكتريكي تراريخت گرديد. بعد از طراحي آغازگر هاي ويژه القاي نوتركيبي، واكنش PCR با استفاده از حامل pKD3 (داراي كاست كلرامفنيكل كه با تواليهاي FRT همجوار شده است) اجرا شد. تراريخت سازي كاست آنتي بيوتيكي پس از خالص سازي، در سويه شيگلا بومي حامل pKD46 با استفاده از روش شوك الكتريكي انجام شد. سويه جهش يافته با جايگزيني كاست كلرامفنيكل با ژن virG از طريق وقوع نوتركيبي هومولوگ به دست آمد. سپس كاست آنتي بيوتيكي با به كارگيري پلاسميد كمكي pCP20 (حامل آنزيم FLP ريكامبيناز) از طريق جايگاه هاي FRT حذف گرديد. صحت فرآيند از طريق بررسي خصوصيات فنوتيپي (رشد سويه مقاوم به كلرامفنيكل) و ژنوتيپي (واكنش PCR با آغازگر هاي خارجي و سپس توالي يابي محصول آن) مورد تاييد قرار گرفت. نتايج به دست آمده حاصل از تعيين توالي ژن virG در مقايسه با سويه استاندارد (با شماره دسترسيCP000035)، هم خواني كامل (100 درصد) را تاييد نمود. اطلاعات حاصل ازآناليز بيوانفورماتيكي حذف 3220 جفت باز از ژن virG را در سويه جهش يافته نشان داد. استفاده از سيستم ? Red recombinase ايجاد جهش را تسهيل و در مقايسه با ساير روشها مانند حاملهاي انتحاري، روشي موثر و ارزان تر مي باشد.

Shigella and enteroinvasive Escherichia coli (EIEC) strains are belong to the gram negative bacterium family which cause the most communicable of bacterial dysenteries (shigellosis). The virG gene as an essential factor is required for pathogenicity of shigella. This protein encoded via virG gene which located on the outer membrane (OM) of bacteria surface. Furthermore, the VirG protein belonging to autotransporter (AT) protein family of extracellular proteinʹs gram-negative bacteria. This protein interacts with the host actin regulatory protein which caused intra- and intercellular spreading throughout the host epithelium. One approach for construction of Shigella vaccines is to attenuate wild-type strains by mutating genes which regulate specific virulence properties. The aim of this research was identification, cloning, sequencing virG gene and construction of a live attenuated Delta virG by use of the Landa Red recombinase in Shigella dysenteriae type 1isolated from patients with shigellosis. By use of serological and Polymerase Chain Reaction (PCR) tests, species and serotype of shigella seperated from patient was confirmed. According to the Gene Bank database (NCBI), detection primers of virG gene was designed, after amplification of virG, this construct was cloned to pGEM-7zf vector as cloning vector. Finally, sequencing was performed by use of universal primers of vector. The pKD46 as helper plasmid (composed of the essential genes for induce recombination under arabinose promoter) was transformed to the native shigella by using electroporation. After designing the primes which require for induction recombination, the PCR reaction performed through pKD3 vector (which compose of chloramphenicol cassette flanked by FRT sequence). After purification of chloramphenicol cassette, this cassette transformed to the native shigella which carrying pKD46 by using electronic shock. Mutant strain obtained by occurring homologous recombination between chloramphenicol cassette and virG gene. Then, antibiotic cassette was eliminated via FRT sites by application of pCP20 (carrying FLP recombinase) as helper plasmid. Precision of process was confirmed by phenotypic (growth resistant strain to chlramphenicol) and genotypic (PCR reaction with external primers and then sequencing of its product) characterization. The result sequencing of virG in comparison with standard strain as reference strain (Accession No. CP000035) was identical (100%). According to bioinformatics analysis mutant strain, deletion of 3220 bp of virG gene was confirmed. Utilization of ? Red recombinase system facilitates mutant construction in more cost-effective method in comparison with the other techniques such as suicide vector.