خالص سازي و شناسايي نسبي پيگمان كاروتنوييدي Haloarcula sp. IRU1 آركي بسيار نمك دوست جدا شده از درياچه نمك اروميه

Partial purification and characterization of carotenoid pigment from Haloarcula sp. IRU-I, an extremely halophilic archaeon isolated from Uromia salt lake

يك سويه آركيايي بسيار نمك دوست و مقاوم به پرتوهاي پونيزه كننده گاما و نور فرابنفش به نام Haloarcula sp. IRU1 كه از آب درياچه اروميه جداسازي شده قادر به توليد رنگيزه هاي كاروتنوييدي است. در اين تحقيق، ابتدا به منظور استخراج كاروتنوييد ها، پس از امتحان روشهاي متداول و استفاده از حلالهاي مختلف در نهايت، شكستن سلول به كمك پودر شيشه نسبتاً نرم و استفاده از حلالهاي استون و هگزان به عنوان بهترين روش انتخاب گرديد. سپس جداسازي پيگمانها به روش كروماتوگرافي با لايه نازك انجام شد. بدين منظور، حلالهاي مختلف با نسبتهاي متفاوت مورد بررسي قرار گرفت و بهترين الگوي جداسازي، با استفاده از حلالهاي استون و پتروليوم اتر و به ترتيب با نسبت 35 : 65 به دست آمد. در اين حالت شش باند مختلف بر روي پليت TLC مشاهده شد كه بزرگترين و قوي ترين باند در قسمت پايين و با كمترين مقدار RF بود. همچنين در اين مرحله، از تعدادي استاندارد كاروتنوييدي براي شناسايي مقدماتي پيگمانها استفاده گرديد. بزرگترين باند مشاهده شده بر روي صفحه TLC ( 70 درصد ،17/0 Rf-value: ) به عنوان پيگمان اصلي در اين باكتري در نظر گرفته شد. سپس جذب نوري پيگمان اصلي در ناحيه طول موجهاي 600-300 نانومتر اندازه گيري شد كه طيف حاصله و نقاط ماكزيمم به دست آمده نشان دهنده شباهت ساختماني اين كاروتنوييد با باكتريوروبرين است. نتايج FT-IR كاروتنوييد اصلي نيز شباهت زيادي بين پيگمان كاروتنوييدي اصلي Haloarcula sp. IRU1 و باكتريوروبرين كه داراي 13 پيوند دوگانه كانجوگه و چهار گروه هيدروكسيل نوع سوم است، را نشان مي دهد. البته در طيفFT-IR كاروتنوييد اين آركي علاوه بر مشاهده كششهاي مربوط به پيوندهايC_O و O_H در طيف حاصل كه به خوبي قابل تشخيص مي باشد، كشش نسبتاً ضعيفي نيز مربوط به گروه كتوني نيز قابل مشاهده است. از طرف ديگر، نتايج اسپكتروفتومتري جرمي وزن مولكولي 783 را براي اين پيگمان نشان مي دهد كه 43 دالتون با وزن مولكولي باكتريوروبرين اختلاف دارد. بر طبق اطلاعات به دست آمده از طيف H-NMR، علاوه بر مشخصه هاي ساختار كاروتنوييد باكتريوروبرين، مي توان حضور يك گروه متيل كتون را نيز در ساختار اين كاروتنوييد مورد توجه قرار داد. بنابراين، با توجه به نتايج به دست آمده از طيف سنجيهاي انجام شده براي شناسايي پيگمان اصلي در اين باكتري پيشنهاد مي شود كاروتنوييد اصلي اين آركيهالوفيل نيز مانند ساير باكتريهاي اكستريم هالوفيل، كاروتنوييد باكتريوروبرين مي باشد كه در اين جا به صورت استري شده با گروه استات وجود دارد.

An extremely halophilic archaeon, Haloarcula sp. IRU1 which isolated from Uromia lake can produce carotenoid pigments. In this study, we assayed several methods for pigment extraction by using different solvents, ultimately, the cell breakage by employing relatively soft glass powder and acetone:hexane as solvents was selected as the best method. Then, the pigments were separated by Thin Layer Chromatography. In order to pigment separating, we examined several solvents with different percentages and the best separating was performed with acetone:petroleum ether (35:65; v/v). There were appeared six bands on TLC plate and the first one with the least RF was the most high intensity band. A few carotenoid standards were used for primary identification of pigments. The highest intensity band on TLC plate was determined as the main pigment component in this archaeon and was scraped off from TLC for identification. For pigment analyzing, UV-Visible, FT-IR, Mass Spectrometry and NMR spectrums of this band were taken and compared with present references. These results suggested the main pigment of this archaeon is bacterioruberin which is sterified with acetate group.