ناپايداري ساختارهاي ساقه - حلقه در جلوگيري از بيان ژنهاي مسيول مقاومت در برابر آلودگيهاي ويروسي در توتونهاي تراريخت

The instability of the inhibition of the expression of genes involved in resistance to virus infection in transgenic plants using hairpin constructs

بيان ساختارهاي ساقه - حلقه در گياهان تراريخت موجب تحريك چرخه خاموشي ژن با استفاده از مولكولهاي dsRNA داراي مشابهت در توالي با mRNA موجود در گياه مي شود. در اين پژوهش با استفاده از گياهان توتون تراريخت (N. tabacum cv. Samsun, NN)كه ژن (RNA-Directed-RNA Polymerase-1) RDR1 آنها توسط ساختارهاي ساقه- حلقه داراي مشابهت ژنتيكي با ژن RDR1 با اندازه هاي متفاوتي خاموش شده بود ميزان پايداري خاموشي ژن بررسي شد. به منظور بررسي پايداري خاموشي ژن، ميزان حساسيت به آلودگي سيستميك ويروس (Potato virus Y strain o) PVY° و نيز ميزان بيان ژن RDR1 بررسي شد. توسط آزمون RT-PCR نيمه كمي (semi-quantitative RT-CR) ميزان بيان ژنهاي دخيل در مقاومت گياهان به آلودگيهاي ويروسي شامل ژنهاي IVR ، AOX1، ERF5 و نيز RDR6يك هفته پس از مايه زني نسلهاي دوم (T2) و سوم (T3) توتونهاي تراريخت كه ژن RDR1 در آنها خاموش شده بود با ويروسPVY° بررسي شد. نتايج اين تحقيق نشان داد نسل دوم توتونهاي تراريخت نسبت به نسل بعدي از ميزان بيان كمتر ژن RDR1 و ساير ژنهاي دخيل در مقاومت برخوردار مي باشد. همچنين لاين هاي نسل دوم (T2) توتونهاي تراريخت در مقايسه با نسل سوم (T3) از حساسيت بيشتر به ويروسPVY° برخوردار بوده و ميزان بيان ژن RDR1 در نسل سوم معادل با توتون غير تراريخت بود. نتايج نشان داد كارآيي ساختار ساقه - حلقه در خاموشي ژن RDR1 در نسل بعد كاهش يافته است. از آنجايي كه ژن RDR6 تحت تاثير ژنRDR1 بوده و براي انتقال پيام خاموشي در طول گياه و افزايش مقاومت گياهان به آلودگي ويروسي لازم مي باشد، پيشنهاد مي كنيم كه سركوب ژن RDR1 در توتونهاي تراريخت موجب جلوگيري از بيان ژن RDR6 و در نهايت موجب كاهش انتقال عمودي ساختارهاي ساقه - حلقه خاموش كننده به نسل بعد شده است.

Transgenic expression of hairpins can induce RNA silencing pathways by means of dsRNA with sequence homology to a plant mRNA. Using transgenic tobacco plants (N. tabacum cv. Samsun NN) in which the RDR1 gene was silenced to different extents by a hairpin structure homologous to the tobacco RDR1 gene, we evaluated the stability of gene silencing, by analyzing the RDR1 gene expression levels and the plant susceptibility to systemic infection by PVY°. The second (T2) and third (T3) generations of RDR1 silenced transgenic lines were tested by semi-quantitative RT-PCR to evaluate the expression levels of defense-related genes including IVR, ERF5, AOX1, and RDR6, one week after PVY° infection. The results showed that T2 transgenic tobacco lines transcribed the RDR1 and the other defense-related genes to a lower level than the corresponding T3 transgenic lines. The T2 lines were more susceptible to PVY° infection than the T3 lines and the RDR1 gene was expressed to the same level in the T3 lines as in non-transformed tobacco. The efficiency of hairpin structure-mediated silencing of the RDR1 gene decreased through different generations. As the RDR1-regulated RDR6 is required for the spreading of silencing throughout the plant, we propose that suppressing RDR1 leads to inhibition of RDR6, which then leads to loss of silencing by the RDR1 hairpin transgene after vertical gene transmission.