پديد آورندگان :
بخشي، مصطفي نويسنده PhD Student in Nanobiotechnoligy, Biology Research Center, Faculty of Basic Science, Imam Hossein University, Tehran, Iran Bakhshi, Mostafa , ابراهيمي، فيروز نويسنده Assistant Professor, Department of Clinical Biochemistry, Biology Research Center, Faculty of Basic Science, Imam Hossein University, Tehran, Iran Ebrahimi, Firouz , زرگان، جميل نويسنده Assistant Professor, Department of Toxicology, Biology Research Center, Faculty of Basic Science, Imam Hossein University, Tehran, Iran Zargan, Jamil , نظريان، شهرام نويسنده Assistant Professor, Department of Microbiology , Biology Research Center, Faculty of Basic Science, Imam Hossein University, Tehran, Iran Nazarian, Shahram , شيخ زاده، وحيده نويسنده MSc in Food Science and Technology, Islamic Azad University, Quchan Branch, Quchan, Iran Sheikhzade, Vahideh
كليدواژه :
Western blotting , espA gene cloning , Intestinal pathogen , recombinant expression
چكيده فارسي :
Normal
0
false
false
false
EN-US
ZH-TW
AR-SA
MicrosoftInternetExplorer4
چكيده
سابقه و هدف: باكتری E. coliO157:H7 جزء پاتوژن‌های روده‌ای می‌باشد كه آسيب‌های جدی در دستگاه گوارش پديد می‌آورد. اتصال باكتری در روده بزرگ به واسطه يك سری از فاكتورهاي
بيماری زا صورت می‌پذيرد كه پروتئين‌های ترشحی نوع 3 نيز جزء اين فاكتورها دسته‌بندی می‌شوند. در بين پروتئين‌های موجود در سيستم مذكور، پروتئين EspA نقش اصلی و مهم را در پيكره شكل‌گيری اين سيستم ايفا می‌كند. هدف از انجام اين تحقيق همسان‌سازی و بيان اين پروتئين به شكل نوتركيب
جهت دستيابی به يك ساختار و منبع پايدار برای توليد آن به منظور بررسی‌های آينده به عنوان كانديد واكسن می‌باشد.
مواد
و روش‌ها: طراحی پرايمر اختصاصی برای ژن espA توسط نرم‌افزار Oligo
7 انجام شد و
تكثير ژن توسط واكنش PCR از روی DNA الگو صورت پذيرفت. واكنش‌هاي
هضم آنزيمی و الحاق ژن درون وكتور بيانی pET28a(+) انجام شد. پس از تأييد همسان سازی ژن مورد نظر، بيان نوتركيب پروتئين EspA با استفاده از القاءگر مصنوعی IPTG صورت پذيرفت. آناليز وسترن بلات نيز برای تأييد پروتئين EspA صورت پذيرفت.
يافته‌ها: همسان سازی ژن espA درون وكتور pET28a(+) به شكل مناسب بين جايگاه های مربوطه صورت پذيرفت و
پروتئين EspA پس از القا، بيان نوتركيب مناسب و قابل توجهی را
نشان داد. آنتی‌بادي
مورد استفاده در وسترن بلات نيز توانست به شكل مناسبی EspA را شناسايی كند.
استنتاج: ساختار نوتركيب پايدار محتوی ژن espA توليد
گرديد كه بيان نوتركيب قابل توجهی از پروتئين را نشان داد. بنابراين پروتئين EspA را می‌توان در مطالعات آينده برای بررسی ميزان ايمن‌سازی عليه E. coli O157:H7 مورد بررسی قرار داد.
/* Style Definitions */
table.MsoNormalTable
{mso-style-name:"Table Normal";
mso-tstyle-rowband-size:0;
mso-tstyle-colband-size:0;
mso-style-noshow:yes;
mso-style-priority:99;
mso-style-qformat:yes;
mso-style-parent:"";
mso-padding-alt:0cm 5.4pt 0cm 5.4pt;
mso-para-margin:0cm;
mso-para-margin-bottom:.0001pt;
mso-pagination:widow-orphan;
font-size:11.0pt;
font-family:"Calibri","sans-serif";
mso-ascii-font-family:Calibri;
mso-ascii-theme-font:minor-latin;
mso-fareast-font-family:PMingLiU;
mso-fareast-theme-font:minor-fareast;
mso-hansi-font-family:Calibri;
mso-hansi-theme-font:minor-latin;
mso-bidi-font-family:Arial;
mso-bidi-theme-font:minor-bidi;}
چكيده لاتين :
Abstract
Background and purpose: E. coli O157:H7 is one of the intestinal pathogens that mediate serious damages in gastrointestinal track. The bacterium attachment in large intestine is mediated via some colonization factors mainly Type III secretion proteins that are involved in this process. Among these factors, EspA protein plays an important role in system foundation. The aim of this study was cloning and recombinant expression of EspA in order to achieve a stable construct for the protein production and using it as a vaccine candidate in future investigations.
Materials and methods: Specific primers were designed by Oligo 7 software and gene amplification was performed by PCR technique on template DNA. Enzymatic digestion and ligation were done by restriction enzymes and T4 ligase enzyme, respectively. Recombinant expression of EspA was induced by IPTG following cloning confirmation. Protein confirmation was done by Western blotting analyze.
Results: Results showed that cloning of espA in pET28a (+) vector was performed in an appropriate mode between expected sites. Also, EspA had good and remarkable recombinant expression after induction and the antibody used in western blotting could recognize EspA on nitrocellulose membrane.
Conclusion: Stable recombinant construct containing espA gene was fabricated that showed appropriate recombinant expression of protein. So, this protein could be used in future studies as a vaccine candidate against E. coli O157:H7.
