بهينه سازي تركيب شيميايي محيط كشت سلولي معين براي توليد ايمونوتوكسين نوتركيب اونتاك

Optimization of Chemically Defined Cell Culture Media for Recombinant ONTAK Immunotoxin Production

زمينه و اهداف: ايمونوتوكسين يك پروتيين سمي است كه به عنوان يك تركيب نوين براي درمان سرطان پيشنهاد شده است. اونتاك يك ايمونوتوكسين نوتركيب مي باشد كه از توكسين ديفتري هيبريد شده با اينترلوكين2 تشكيل شده است. در اين مطالعه بهينه سازي تركيب محيط كشت معين بمنظور بيان اونتاك بررسي شده است. مواد و روش كار: در اين تحقيق از باكتري سويه BL21(DE3) ترانسفورم شده با پلاسميد نوتركيب PET-IDZ جهت بيان اونتاك استفاده گرديد. تركيب محيط كشت همچون منبع كربن( گلوكز، ساكارز و گليسرول)، منبع نيتروژن (كلريد آمونيوم، اوره و سولفات آمونيوم)، غلظت هاي مختلفIPTG به عنوان القاگر (0/1 ,5/0 , 1 mM)، زمان القا و غلظت هاي مختلف اسيد آمينه براي افزايش بيان در كشت فلاسك لرزان بر اساس روش تاگوچي بهينه سازي شده است. غلظت سلول بر اساس روش كدورت سنجي اندازه گيري شده و ميزان بيان پروتيين توسط الكتروفورز روي ژلSDS-PAG مورد بررسي قرار گرفته است. يافته‌ها: محيط كشت معين اصلاح شده حاوي (g/l)glucose:8 :، K2HPO4:15، KH2PO4: 7.5، Citric acid:2، NH4CL:3، MgSO4.7H2O:1gl به عنوان محيط كشت بهينه تعيين گرديد. بهترين زمان القا توسط IPTG با غلظت 0.1mM، در كدورت نوريOD600nM=2 تعيين شد. با اضافه كردن اسيدهاي آمينه (g/l):Valine,0.0502; Pheyalanine,0.0132; Lysine,0.0184; Aspartic acid,0.0160; Serine,0.0251، به محيط كشت، بيان پروتيين اونتاك افزايش يافته است. نتيجه‌گيري: در پژوهش حاضر، آناليز نتايج به روش تاگوچي مشخص كرد كه نوع منبع نيتروژن (كلريدآمونيوم 3 g/l) تاثير قابل توجهي در رشد سلول داشته است. توليد توده زيستي در محيط كشت بهينه سازي شده نسبت به محيط كشت M9، تقريبا 3 برابر بوده است.

Background and Aim: Immunotoxin is a cytotoxic protein and have been proposed as a novel compound for cancer therapy. ONTAK is a recombinant immunotoxin composed diphtheria toxin fused to interleukin 2(IL2). In this study, optimization of defined culture medium for the expression of recombinant ONTAK immunotoxin has been investigated. Materials and Methods: In this study, the bacterial strain BL21 (DE3) was transformed with the recombinant plasmid PET-IDZ was used to express ONTAK. The medium composition such as carbon source (glucose, sucrose and glycerol), nitrogen source (ammonium chloride, urea and ammonium sulfate) and concentration of the inductor IPTG (0.1, 0.5, 1mM), induction time and concentration of various additives (different amino acids) were optimized based on Taguchi method for increasing expression on the shake flask cultivation. The cell concentration was measured by optical density at 600 nm and protein expression levels were analyzed by electrophoresis on SDS-PAGE gel. Results: Modified defined culture medium containing (g/l): glucose,8.0; K2HPO4,15.0; KH2PO4,7.5; Citric acid,2; NH4Cl,3; MgSO4.7H2O,1; were determined as optimal culture medium. OD600nM=2.0 was determined as the best time for induction by IPTG at a concentration of 0.1mM. ONTAK expression was increased by adding Valine, 0.0502; Phenylalanine, 0.0132; Lysine, 0.0184; Aspartic acid, 0.0160 and Serine, 0.0251(g/l) amino acids to the medium. Conclusions: In present study, the Taguchi method analysis revealed that, nitrogen source type (NH4CL 3 g/l) significantly affects in the cell growth. The biomass production was on the optimized medium about over 3 times higher than that at M9 medium.