توليد آنتي بادي منوكلونال در موش عليه مورفين بدون واكنش متقاطع با هرويين

Production of Mouse Monoclonal Antibody against Morphine without Cross Reactivity with Heroin

مقدمه: سنجش‌های ايمنی برای تشخيص و تعيين مقدار اپيوييدها در خون و ساير مايعات بيولوژيك بر مبنای آنتی‌بادی‌ها می‌باشد. در اين مطالعه توليد آنتی‌بادی منوكلونال عليه مورفين مدنظر بود. روش بررسی: توليد آنتی‌بادی منوكلونال عليه مورفين در موش طبق روش استاندارد هيبريدوما انجام گرفت. بدين منظور، پنج سر موش BALB/c ماده 6 تا 8 هفته‌ای با مشتق 6- مورفين همی سوكسينات كونژوگه با آلبومين سرم گاوی كاتيونيزه شده ايمن‌سازی گرديدند. سلول‌های لنفوسيت B طحال موش‌های ايمن شده با سلول‌های ميلومايی موشی (Sp2/0) با استفاده از پلی‌اتيلن گليكول با يكديگر ادغام شدند. سلول‌های هيبريدوما با رقيق سازی حد تك كلون و تكثير داده شدند. كلاس و زير كلاس آنتی‌بادی منوكلونال توسط كيت ايزواستريپ شركت Roche تعيين شد. به منظور تخليص آنتی‌بادی از افينيتی كروماتوگرافی پروتئينG استفاده گرديد. افينيتی آنتی‌بادی به روش Beatty سنجيده شد. واكنش‌های متقاطع آنتی‌بادی توليدی با مولكول‌های شبه مورفين تعيين گرديد. نتايج: از بين3 كلون ترشح كننده آنتی‌بادی عليه مورفينBSA- بعد از سه بار رقيق‌سازی يك كلون مترشحه پايدار به دست آمد. كلاس آنتی‌بادی حاصل از نوع IgG2b و زنجيره سبك آن از نوع لامبدا (λ) بود. افينيتی آنتی‌بادی حاصل برای مورفين برابر با M-1109 × 8/2 بود. تيتر آنتی‌بادی در محيط رويی سول‌های هيبريدما 1:400 بود. اين آنتی بادی هيچ واكنش متقاطعی با هرويين، نالوكسان، نالتروكسان و پاپاورين نشان نداد. نتيجه‌گيری: آنتی‌بادی منوكلونال توليدی عليه مورفين از افينيتی و ويژگی مناسبی برخوردار بود و با هرويين واكنش متقاطعی نشان نداد. بنابراين اين آنتی‌بادی در طراحی روش‌های سنجش ايمنی برای تشخيص مورفين در مايعات بيولوژيك می‌تواند مورد استفاده قرار گيرد.

Introduction: Immunoassay procedures for detecting and determining opioids in blood and other biologic fluids are based on Monoclonal antibodies. In the present study, monoclonal antibody against Morphine was taken into account. Methods: Hybridoma protocol was used in order to produce the monoclonal antibody against morphine in mice. For this purpose, five 6–8-week old female BALB/c mice were immunized with morphine C6- hemisuccinated derivative conjugated to cationized bovine serum albumin (cBSA). The spleens lymphocytes were fused with SP2/0 cells using polyethylene glycol (PEG). Hybridoma clones were subcloned by limiting dilution. Class and subclass of monoclonal antibody were determined using Roche isostrip test. Moreover, antibody was purified by protein G affinity chromatography and affinity was determined according to the method described by Beatty et al. Finally, the cross reaction of monoclonal antibody was determined with some structurally related molecules such as codeine and apomorphine. Results: Among 3 hybridoma clones that reacted with the morphine-BSA, but not with BSA, after thrice limiting dilution, one stable hybridoma monoclon was obtained. The monoclonal antibody (MAb) was found to be of IgG2b class and subclass and containing lambda light chain. The affinity of the MAb to morphine was obtained 2.8 ×109 M-1 by non competitive enzyme immunoassay. The titer of supernatant of cell culture medium was 1/400. The MAb was cross reacted with codeine (100%) and apomorphine (16.5%), though no reaction was observed with heroin, naloxone, naltrexone, and papavrin. Conclusion: The study findings revealed that the produced antibody against morphine was comparable with other antibodies for specificity and affinity; therefore it is usable in design of diagnostic immunoassay in biologic fluids.