توليد و تخليص توكسين حساس به حرارت باكتري اشريشيا كلي انتروتوكسيژنيك و شناسايي آن با روش الايزاي مبتني بر گيرنده گانگليوزيدي GM1

Production and purification of heat-labile toxin of enterotoxigenic Escherichia coli and its detection by GM1 gangelioside receptor-ELISA based method

چكيده زمينه و هدف: باكتري اشريشيا كلي انتروتوكسيژنيك مهم‎ترين عامل باكتريايي ايجاد كننده اسهال است. عوامل حدت زاي اختصاصي مانند انتروتوكسين‎ها و عوامل كلونيزاسيون، اين باكتري را از ساير گروه‎هاي اي. كلي متمايز مي‎كند. در اين مطالعه توكسين حساس به حرارت تخليص شده و از آن مي‎توان جهت سنجش آنتي توكسين در روش الايزاي مبتني بر گيرنده گانگليوزيدي GM1 و شناسايي باكتري مولد توكسين استفاده كرد. مواد و روش‎ها: اين مطالعه از نوع تجربي است. جهت توليد و تخليص توكسين، ابتدا سويه باكتري مولد توكسين حساس به حرارت كشت داده شد. پروتيين‎هاي محلول در مايع رويي با سولفات آمونيوم ترسيب و توكسين با استفاده از روش‎هاي بيوشيميايي تخليص شد و پروتيين تخليص شده عليه تريس 02/0 مولار در 8=pH دياليز و نمونه بر روي ژل الكتروفورز بررسي گرديد. از روش الايزاي مبتني بر گيرنده گانگليوزيدي GM1 جهت شناسايي و سنجش ميزان توكسين تخليص شده استفاده شد و اثر خنثي كنندگي آنتي بادي ضد زير واحدB روي توكسين حساس به حرارت نيز به اين روش مورد بررسي قرار گرفت. يافته‎ها: وجود باندهاي 28 و 12 كيلودالتوني نشان‎گر تخليص توكسين بود. اين ‎مطالعه نشان داد كه آنتي بادي ضد زير واحدB نوتركيب، توانايي شناسايي توكسين تخليص شده و مهار اتصال آن به گيرنده GM1 را داراست. آنتي بادي ضد زير واحدB نوتركيب مي‎تواند تا 80 درصد از اتصال توكسين به گيرنده GM1 جلوگيري نمايد. نتيجه گيري: تخليص توكسين حساس به حرارت و راه اندازي روش الايزاي مبتني بر گيرنده گانگليوزيدي GM1 كه مي‎تواند در شناسايي دقيق و بررسي اپيدميولوژيك جدايه‎هاي كلينيكي مورد استفاده واقع شود. واژگان كليدي: آنتي بادي ضد زيرواحد B نوتركيب، اشريشيا كلي انتروتوكسيژنيك، روش الايزاي مبتني بر گيرنده گانگليوزيدي GM1، انتروتوكسين حساس به حرارت

Abstract Background: Enterotoxigenic Escherichia coli bacterium is the most important bacterial agent causing diarrhea. Specific virulence factors, such as enterotoxins and colonization factors, distinguish ETEC from other classes of diarrheagenic E.coli. In this study, heat-labile toxin was purified which could be utilized for anti-toxin assay in GM1 gangelioside receptor-ELISA based method and for identification of ETEC producing toxin. Materials and Methods: In this experimental study, bacterial strain producing heat-labile toxin was first cultivated for production and purification of toxin. Then supernatant soluble proteins were precipitated with ammonium sulfate and purified using biochemical methods. Finally, purified protein was dialyzed against Tris 0.02 mM pH 8 and analyzed on gel electrophoresis. GM1 gangelioside receptor-ELISA based method was used for detection and assessment of the purified toxin. Through this method, the effect of anti-recombinant heat-labile toxin B subunit neutralization on heat-labile toxin was investigated. Results: Toxin purification was revealed by the presence of 12 and 28 KD protein bands. This study demonstrated that anti-recombinant heat-labile toxin B subunit antibody can detect the purified toxin and can inhibit its binding to GM1 receptor up to 80%. Conclusion: Purification of heat-labile toxin and gangelioside receptor-ELISA assay can be used for accurate detection and epidemiological study of clinical isolates. Keywords: Antibody against recombinant B subunit, Enterotoxigenic Escherichia coli, GM1 gangelioside receptor-ELISA, Heat-labile enterotoxin