سنجش تومورزايي سلول‏هاي بنيادي زاياي موش مذكر نابالغ تكثير يافته در محيط كشت پس از پيوند به موش بالغ با نقص سيستم ايمني

Investigation of Tumorigenicity ability of Immature Male Mouse Spermatogonial Stem Cells after In Vitro Cultivation and Inoculation in Athymic Animals

هدف: اين فرضيه وجود دارد كه سلول‏هاي بنيادي پس از پيوند، قابليت تومورزايي دارند. سلول‏هاي بنيادي اسپرماتوگوني داراي قابليت تكثيري بالا و كلوني‏زايي بوده كه مربوط به بيان يك‏سري از ژن‏هاي پرتواني نظير ژن c-Myc است؛ بنابراين هدف اصلي اين تحقيق بررسي قابليت تومور‏زايي سلول‏هاي بنيادي اسپرماتوگوني بعد از كشت در آزمايشگاه و پيوند به حيوانات با نقص سيستم ايمني بوده است. مواد و روش‏ها: سلول‏هاي بنيادي اسپرماتوگوني حاصل از بافت بيضه موش 3-5 روزه نر نژاد NMRI پس از دو مرحله هضم آنزيمي، كشت داده شدند. پس از كشت سلول‏هاي بنيادي اسپرماتوگوني به‏مدت يك ماه، كلوني‏هاي به‏دست آمده با استفاده از نشانگر Oct4 و Plzf تعيين ماهيت شدند. سپس بيان ژن‏هاي پرتواني Oct-4، Nanog و c-Myc بررسي شد. تعداد 106× 5 از سلول‏ها به‏صورت زير پوستي به موش با نقص سيستم ايمني پيوند و پس از 8 هفته محل پيوند سلول‏ها از نظر ايجاد تومور ارزيابي شدند. سلول‏هاي بنيادي موشي رده CCE به‏عنوان كنترل مثبت، استفاده شدند. تومور‏هاي به‏وجود آمده با كوليس اندازه‏گيري شد. نتايج: كلوني‏ها پروتيين Oct-4 و PLZF را بيان كردند. ميزان بيان ژن‏هاي پرتواني در اين سلول‏ها به نسبت سلول‏هاي بنيادي جنيني به‏طور معني‏داري پايين‏تر بود. سلول‏هاي بنيادي جنيني موشي تومور ايجاد نمودند ولي كلوني‏هاي اسپرماتوگوني قادر به ايجاد تومور نبودند. نتيجه‏گيري: سلول‏هاي بنيادي اسپرماتوگوني موشي در مقايسه با سلول‏هاي بنيادي جنيني قادر به ايجاد تومور در بدن نيستند. به دليل بيان پايين ژن‏هاي پرتوان به‏ويژه ژن c-Myc قابليت تومورزايي اين سلول‏ها به‏طور معني‏داري كاهش يافته است. با اين حال مطالعه در مورد نمونه انساني نيز بايد بررسي شود.

Objective: It is hypothesized that stem cells have the capability to form tumors after transplantation. Spermatogonial stem cells have proliferation potency and colonization ability related to express pluripotency genes such as c-Myc. The primary aim of this study is to investigate tumorigenicity ability of these cells after in vitro cultivation and inoculation in athymic animals. Methods: Spermatogonial stem cells from 3-5 day-old neonatal mice testes (NMRI) were cultured following two-step enzymatic digestion. After one month of culturing the spermatogonial stem cells, the obtained colonies were identified by Oct4 and PLZF markers. Expressions of Nanog, Oct4 and c-Myc pluripotency genes were subsequently studied. We subcutaneously inoculated 5 x 106 cells into athymic mice and assessed tumor formation after 8 weeks. Mouse embryonic stem cells (CCE line) were used as the positive control. Generated tumors were measured by a caliper. Results: The colonies expressed Oct4 and PLZF proteins. Ratio of pluripotency gene expressions in these cells compared to embryonic stem cells significantly decreased (P?0.05). Mouse embryonic stem cells formed tumors however the spermatogonial colonies did not form any tumors. Conclusion: Mouse spermatogonial stem cells in comparison with embryonic stem cells are not capable of forming tumors in vivo. We have observed that the tumorigenic ability of these cells decreased significantly with down regulation of pluripotency gene expressions, particularly c-Myc. However, this study should be reassessed by using human tissue samples.