طراحي و توليد رده»‌ سلولي بيان كننده ِ ژن‌هاي‌UTR’ 5 و ‌3NS از عامل اسهال ويروسي گاوها ‌(BVDV)‌ به منظور ارزيابي كارآيي روش‌هاي درماني عليه اين ويروس

Design and production of a cell line expressing 5|ʹʹUTR and NS3 genes of bovine viral diarrhea virus (BVDV) in order to evaluate the efficacy of treatments against this virus

زمينه مطالعه:‌ ‌عامل مولد اسهال ويروسي گاو ‌(BVDV)‌ عامل مضرات اقتصادي، بهداشتي قابل توجهي در مزارع پرورش گاو است. به دليل ناكارآمدي نسبي برنامه‌هاي ريشه كني اين ويروس، در سال‌هاي اخير براي مبارزه با آن تدابير متعدد ضد ويروسي نظير ژن درماني به فراواني به كار گرفته شده است. يكي از روش‌هاي ارزيابي كيفيت اين تدابير، استفاده از اين ابزارهاي ضد ويروسي در رده‌هاي سلولي اختصاصي بيان كننده آن ژن از طريق القاي بيان ژن توسط پلاسميد حامل يا عفونت با وكتورهاي ويروسي است. هدف:‌ ‌اين مطالعه با هدف تهيه يك رده ي سلولي بسيار بيان كننده بخشي از ژنوم BVDV براي ارزيابي كارآمدي روش‌هاي درماني و پيشگيرانه عليه اين ويروس انجام شد. روش كار:‌ ‌بدين منظور پس از كشت سويه استاندارد NADL از BVDV و استخراج vRNA، افزوده سازي ژن‌هاي كد كننده ʹUTR5 و ‌3NS از ژنوم اين ويروس و سپس كلونينگ اين قـطعـات ژنـي در پلاسميـد لنتـي ويروسي ‌ pWPI- linker B در فرادست ژن GFP انجام شد. پس از تاييد كلونينگ، لنتي وكتور‌هاي حاوي 3BVDV- NS و ‌ʹUTR5 BVDV-‌ در سلول‌هاي T293 با استفاده از سيستم packaging نسل سوم توليد شدند. در مرحله بعد سلول‌هاي MDBK بيان كننده دايمي ‌ʹUTR5 و ‌3NS با استفاده از عفونت با لنتي ويروس‌هاي بيان كننده 3BVDV- NS و ‌ʹUTR5 BVDV-‌ توليد گرديدند. نتايج:‌ ‌كارآمدي عفونت با لنتي وكتورهاي حامل ترانس ژن با آزمون‌هاي مشاهده مستقيم با ميكروسكوپ فلورسنت، وسترن بلاتينگ و RT-PCR بررسي و با گروه كنترل مقايسه گرديد و حضور و بيان ژن‌هاي مورد نظر تاييد شد. نتيجه‌گيري‌نهايي:‌ نتايج نشان دهنده توليد موفقيت آميز رده ي سلولي MDBK بسيار بيان كننده اين دو ژن از BVDV بود و لنتي وكتورها به دليل بيان طولاني مدت و پايدار ژن تا چندين نسل سلولي و امكان عفوني نمودن بسياري از رده‌هاي سلولي نسبت به ساير وكتورهاي ويروسي ارجحيت دارند.

BACKGROUND: Bovine viral diarrhea virus (BVDV) causes significant economic and health effects in cattle farms. Because of the relative inefficiency of BVDV eradication programs, in recent years, numerous strategies such as anti-viral gene therapy has been used extensively to fight it. One of the ways to evaluate the quality of these anti-viral strategies is the study of their efficacy in the specific cell lines expressing those viral genes through the induction of gene expression by transfection of plasmids or infection of viral vectors. OBJECTIVES: This study was performed for preparation of a cell line expressing some portions of BVDV genome to evaluate the efficacy of preventive and therapeutic strategies against this virus. METHODS: After the culture of BVDV NADL, vRNA was extracted and proliferation of 5ʹUTR and NS3-coding genes and cloning of these gene segments was performed in the upstream of GFP gene in pWPI-linker B lentivirus plasmid. After confirmation of cloning, lentiviral vector containing BVDV-NS3 and BVDV-5ʹUTR were generated in 293T cells using third-generation packaging system. Then MDBK cells persistently express 5ʹUTR and NS3 were generated by the infection with lentiviral vectors containing BVDV-NS3 and BVDV-5ʹUTR. RESULTS: The efficacy of infection with lentiviral vectors carrying transgenes, examined by fluorescence microscopy, Western blotting and RT-PCR tests, were compared with control groups and the presence and expression of the above mentioned genes were confirmed. CONCLUSIONS: The results indicate that the successful production of a MDBK cell line expressing both genes of BVDV and lentiviral vectors are preferred to the others for their persistent and long-term gene expression in several cell generations and the ability to infect many different cell lines.