اثر استراديول بر بيان ژن آنزيم هاي استروژنيك و پروژستژانيك در سلول‌هاي گرانولوزا گاو هلشتاين در شرايط برون تني

Effect of estradiol on relative gene expression of estrogenic and progestagenic enzymes in Holstein cow granulosa cells in vitro

هدف از مطالعه حاضر بررسي تاثير استرادايول بر بيان نسبي ژن هاي گيرنده FSH (FSHR)، گيرنده LH (LHR)و آنزيم هاي استروژنيك و پروژستاژنيك (Progestagenic) در سلول هاي گرانولوزاي كشت داده شده گاو هلشتاين بود. به طور خلاصه، فوليكول هاي دو تا پنج ميلي متري از تخمدان گاوهاي بالغ از كشتارگاه جمع آوري شدند، پس از جدا كردن سلول هاي گرانولوزا در محيط DMEM/F12 به مدت شش روز در در پليت هايي 24 تايي كشت داده شدند و به منظور شمارش تعداد سلول ها از رنگ تريپان بلو 4/0 درصد استفاده شد. تيمارها شامل 1) 500 هزار سلول گرانولوزا در ml 500 محيط كشت، 2) 500 هزار سلول گرانولوزا در ml 200 محيط كشت، 3) 500 هزار سلول گرانولوزا در ml 500 محيط كشت و استراديول و 4) 500 هزار سلول گرانولوزا در ml 200 محيط كشت و استراديول بودند. براي اندازه گيري استراديول محيط هاي كشت در روز شش جمع آوري شدند بر اساس روش راديوايمونواسي (RIA)، غلظت استراديول اندازه گيري شد. سلول ها بوسيله ترايزول جمع آوري شدند و تا زمان استخراج RNA در 80- درجه سانتيگراد نگهداري شدند. داده ها با استفاده از نرم افزار JMP مورد تجزيه و تحليل قرار گرفتند. نتايج نشان داد افزودن استراديول به محيط كشت سلول هاي گرانولوزاي گاو، از يك سو با افزايش بيان ژن آنزيم هاي كليدي در تبديل اندروژن به استراديول (آنزيم هاي استروژنيك) غلظت استراديول توليد شده به وسيله سلول هاي گرانولوزا را افزايش داد. از سوي ديگر مسير ساخت پرژوسترون را با كاهش بيان ژن آنزيم هاي كليدي در تبديل كلسترول به پروژسترون (آنزيم هاي پروژستژانيك) مهار كرد و در نهايت سبب كاهش لوتيينه شدن و بهبود سلامت فوليكول شد.

The objective of this study was to determine the effect of estradiol on mRNA levels encoding FSH receptor (FSHR), LH receptor (LHR), estrogenic and progestagenic enzymes. Briefly, follicles between 2 and 5 mm diameter were dissected from the ovaries of adult cows collected from a local abattoir, cells were collected by rinsing the follicle walls with Dulbecco Modified Eagle medium/F12 (DMEM/F12). A viable cell count was performed in the presence of 0.4 % Trypan Blue and were cultured in 24-well plates for 6 days. Treatments were 1) 500,000 cell/500 ml, 2) 500,000 cell/200 ml, 3) 500,000 cell/500 ml and estradiol 4) 500,000 cell/ 200 ml and estradiol. To measure steroid secretion, the medium was removed for steroid assay on day 6 and measured by RIA. To measure mRNA abundance, cells were collected into Trizol and stored at ?80 °C until RNA extraction. All data were analyzed by JMP (SAS). Results showed that addition of estradiol to granulosa cell culture medium was stimulated the E2 synthesis in granulosa cells by increasing key enzymes involved in the conversion of androgens to E2 (estrogenic enzyme) and also inhibited the progestin synthetic pathway by decreasing mRNA level of progestagenic enzyme involved in the conversion of cholesterol to P4 and finally decreasing luteinization and improve follicle healthy or oocyte developmental competence.