كلون و بيان فوتوپروتيين اكورين با استفاده از دنباله اينتيين

Cloning and expression of aequorin photoprotein using intein tag

زمينه: اينتيين (INT) بخش‌هاي دروني پروتيين است كه مي‌تواند در طي فرايند پيرايش پروتيين، خود را از پروتيين نابالغ جداكند. اين توالي براي جدا شدن، احتياج به آنزيم يا كوفاكتور خاصي ندارد. از اين توالي پروتييني و ويژگي برش خود به خودي آن، در اثر اعمال تغيير دما، pH و يا القاي تيولي در جهت تخليص پروتيين استفاده مي‌شود. مزيت اين روش نسبت به بقيه روش‌هاي تخليص پروتيين، عدم احتياج به آنزيم‌هاي پروتيازي و مراحل حذف پروتياز مي‌باشد كه اين روش را از لحاظ اقتصادي حايز اهميت مي‌كند. در تحقيق حاضر فوتوپروتيين اكورين به‌صورت ملكولي با INT هيبريد شده و ميزان بيان آن مورد ارزيابي قرار گرفته است. مواد و روش‌ها: در اين تحقيق ژن رمز كننده اكورين كه در مطالعات قبلي درون وكتور pET21a كلون شده بود با استفاده از پرايمرها و آنزيم‌هاي محدودگر اختصاصي درون وكتور pTYB21، كه حاوي دنباله INT است، كلون گرديد. سپس وكتور pTY-aequorin حاصله به باكتري E.coli سويه بياني ER2566 انتقال داده شد و با تكنيك‌هاي الكتروفورز (Electerophoresis)، وسترن بلات (Western Blot) و تعيين ترادف (Sequencing)، صحت كلون‌ها بررسي گرديد. يافته‌ها: ژن به رمز درآورنده فوتوپروتيين اكورين بين جايگاه هاي آنزيمي SapI و PstI درون وكتور pTYB21 به‌صورت صحيح كلون گرديد و بيان پروتيين هيبريدي اكورين- اينتيين با استفاده از روش‌هاي مرسوم تاييد گرديد. نتيجه‌گيري: ساخت سازه ژني فوتوپروتيين اكورين، در حالت هيبريدي و متصل به INT با استفاده از روش‌هاي ملكولي تاييد شد. همچنين ميزان بيان اكورين در حالت متصل شده با INT، درصد بيان بيش از 25 درصد مجموعه پروتيين‌هاي سلولي را نشان مي‌دهد

Background: Intein (INT), is the internal parts of the protein which can be separated from the immature protein during protein splicing process. This sequence requires no specific enzyme or cofactor for separation. This protein sequence and their characteristic of self-cleavage by thiol induction, temperature and pH changes is used for protein purification. The advantage of this method compared to the other protein purification methods is that it doesn’t require any protease enzyme and protease removal steps that make this method important economically. In this study, aequorin photoprotein was hybridized with INT in molecular form and its expression was evaluated. Materials and Methods : In this study, aequorin coding gene that was cloned in pET21-a in the previous studies, was cloned in pTYB21 vector containing INT tag by specific primers and restriction enzymes. Then the resulting pTY-aequarin was transformed to the ER2566 expression strain and cloning accuracy was confirmed by electrophoresis, western blotting and sequencing. Results: The photoprotein aequorin was cloned into SapI/PstI restriction site of pTYB21 plasmid accurately and successfully. Aequorin- INT hybrid protein expression confirmed using traditional methods. Conclusion: The photoprotein aequorin constract in fused with INT confirmed by molecular methods. Also rate of Aequorin- INT expression determined about %25 of cell total protein.