شناسايي مولكولي ژن فسفوگليسرات كيناز از مواد دفعي- ترشحي انگل توكسوكارا كنيس

Molecular identification of phoshphoglyceate kinase gene from the secretory-excretory antigens of Toxocara canis

انگل توكسوكارا كنيس گسترش جهاني دارد و علت اصلي بيماري مشتركي بين انسان و دام است كه توكسوكاريوز ناميده ميشود. عفونت در انسان عمدتاً در اطفال متعاقب بلع تصادفي تخم انگل جنين دار كه در خاك وجود دارد و يا از طريق غذا و دست هاي آلوده اتفاق مي افتد. در اين پژوهش، آغازگرهاي اختصاصي براي ژن كد كننده فسفوگليسرات كيناز از انگل توكسوكارا كنيس با استفاده از (Expressed sequence tag) EST موجود در بانك ژن (با شماره دسترسي HO348231)، طراحي گرديد و سپس با استفاده از تكنيك Semi-Nested RT-PCR آن قطعات ژني تكثير گرديدند. قطعه ژن كد كننده فسفوگليسرات كيناز با موفقيت تكثير و به منظور شناسايي ملكولي در پلاسميد pMALc2x همسانه سازي گرديد. مجموع كل RNA از نمونه ها استخراج و سپس به منظور ساخت cDNA، از آن به عنوان رونوشت و از اليگو (dT) به عنوان آغازگر استفاده گرديد. در ادامه پس از بهينه‌سازي شرايط PCR، قطعه ژني به طول 304 نوكليوتيد تكثير گرديد و به منظور تسهيل در امر همسانه سازي محصول RT-PCR و وكتور pMAL، به وسيله آنزيم هاي محدودالاثر BamHI و HindIII هضم شده و سپس توسط آنزيم ليگاز به يكديگر متصل شدند. پلاسميد نوتركيب به دست آمده جهت تكثير به باكتري E.coli سوش BL21 منتقل و توالي آن بررسي گرديد. توالي 304 نوكليوتيدي به دست آمده قطعه پروتييني حاوي 101 اسيد آمينه با وزن ملكولي 497/10 كيلو دالتون و نقطه ايزو الكتريك 5 را كد ميكند. مقايسه اين ژن با ژنهاي مشابه از ديگر نماتودها، داميني به نام "Phosphoglycerate kinase superfamily" را نشان داد. همترازي توالي به دست آمده نشان داد كه اين ژن با ژن فسفوگليسرات كيناز از انگل Ascaris suum، 95 درصد مشابهت دارد. مشابه اين ژن با نماتودي ديگر به نام Brugia malayi و همچنين فيلاريايي به نام loa loa 85 درصد همخواني دارد.

Toxocara canis has a worldwide distribution and is regarded as the main cause of human toxocariasis. Infection in humans, particularly children, is frequently caused by accidental ingestion of embryonated Toxocara eggs present in soil, water, food, dirty hands. In this study, C-terminus part of an expressed sequence tag (EST) encoded phoshphoglycerate kinase gene was selected from the NCBI Genbank (accession number HO348231) and amplified using semi-nested RT-PCR. CDNA was synthesized with the extracted total RNA as template and the modified oligo (dT) as primer. The product of RT-PCR and pMalc2x expression vector both were digested by BamHI and HindIII restriction enzymes and ligated. This construct was eventually transferred to bacterium E. coli, strain TG1. After plasmid purification, the insert was sequenced and characterized. Sequence comparisons with GenBank database were done using the BLAST software. Based on the sequence data, the complete sequence contained 304 nucleotides encoding an open reading frame of 101 amino acid residues with a predicted molecular mass of 10.497 kDa and theoretical pI of 5. The results of this study indicated that the C-terminus part of phosphoglycerate kinase was successfully cloned and expressed in E. coli. Analysis of recombinant protein showed that part of this protein belongs to "phosphoglycerate kinase superfamily". Multiple aligenment shows that TcPGK had 95% and 85% similarity with phosphoglycerate kinase from Ascaris suum and also Loa loa and Burigia malayi, respectively.