كلونينگ و بيان پروتيين نوتركيب VP2 پارو ويروس سگي در دو سيستم باكتريايي و پروكاريوتي بدون سلول

Expression and cloning of recombinant VP2 protein of canine parvovirus in bacterial and cell-free prokaryotic systems

چكيده زمينه و هدف: اهميت پروتيين VP2 پاروويروس سگي در اتصال به سلول‎هاي سرطاني انساني و كيت‎هاي تشخيصي دامپزشكي سبب شده تا مطالعات گسترده‎اي در زمينه توليد اين پروتيين صورت گيرد. هدف از انجام اين پژوهش كلونينگ و تاييد بيان پروتيين پوششي VP2 پاروويروس سگي در سيستم پروكاريوتي و بهينه نمودن بيان پروتيين VP2 در سيستم منحصر به فرد پروكاريوتي بدون سلول مي‎باشد. مواد و روش‎ها: در اين مطالعه تجربي، پلاسميد pET-21a VP2 با كلون كردن محصول PCR ژن VP2 پاروويروس سگي در پلاسميد بياني pET-21a ساخته شد. توالي كلون شده ابتدا با روش كلوني PCR ارزيابي شده، سپس توسط هضم آنزيمي و توالي يابي مورد بررسي قرار گرفت. به منظور توليد پروتيين VP2 پلاسميد pET-21a VP2 در باكتري E.coli سويه روزتا Rosetta(DE3) منتقل و بيان اين پروتيين توسط IPTG القا گرديد. پروتيين توليد شده در هر دو شرايط باكتريايي و بدون سلول توسط تكنيك SDS PAGE بررسي گرديد و در نهايت به وسيله آنتي بادي منوكلونال عليه VP2 توسط تكنيك وسترن بلات ارزيابي گرديد. يافته‎ها: كلونينگ صحيح ژن VP2 با هضم آنزيمي و تعيين توالي قطعه كلون شده به اثبات رسيد. بيان پروتيين VP2 در دو سيستم باكتريايي و بدون سلول توسط SDS PAGE تاييد شده و در نهايت پروتيين VP2 به وسيله وسترن بلات تاييد گرديد. نتيجه‎گيري: نتايج اين تحقيق نشان داد، ژن VP2 در طي مراحل كلونينگ تكثير شده و به خوبي در وكتور مورد نظر كلون گرديده است و بيان پروتيين در هر دو سيستم باكتريايي و بدون سلول به طور كامل مورد تاييد قرار گرفته است. واژگان كليدي: سيستم بدون سلول، بيان پروتيين سطحي، پاروويروس، ژن VP2

Abstract Background: The importance of VP2 protein of canine parvovirus to bind to human cancer cells and to detect the virus in veterinary detection kits has motivated a lot of research on the production of this protein. In this project, a surface gene of canine parvovirus (VP2) was cloned and expressed in a prokaryotic vector system and its expression was optimized in a specific cell-free prokaryotic expression system. Materials and Methods: In this experimental study, plasmid pET-21aVP2 was constructed by cloning the PCR product of VP2 gene of canine parvovirus into the plasmid expression pET-21a vector. The best sequence was analyzed through PCR and it was followed by confirmation with sequencing and restriction digestion. To produce VP2 protein, plasmid pET-21aVP2 was transferred into Escherichia coli, Rosetta (DE3) strain, and the expression of this protein was induced by IPTG. The production of VP2 protein in both systems was evaluated using SDS PAGE technique. The expressed protein was checked with monoclonal antibody against VP2 protein by Western blotting technique. Results: Successful cloning of VP2 protein was confirmed by enzymatic digestion and sequencing. The expression of VP2 protein in bacterial and cell-free prokaryotic systems was verified by SDS PAGE and the specific band in Western blotting also confirmed the VP2 protein. Conclusion: The results of this study showed that VP2 gene was amplified in the cloning phases and it was successfully cloned in the expression vector. Protein expression was confirmed in both bacterial and cell-free prokaryotic systems. Keywords: Cell-free system, expression of surface protein, parvovirus, VP2 gene