كلونينگ و بيان پروتيين نوتركيب فلاژلين FlaA ويبريو كلرا و بررسي خواص آنتي ژنيكي آن

Cloning and expression of the Vibrio cholera recombinant FlaA Flagellin protein and evaluation of its antigenicity characteristics

چكيده زمينه و هدف: ويبريو كلرا عامل بيماري كلرا در انسان مي‎باشد. بيان فلاژل و تحرك باكتري در كلونيزاسيون و ويرولانس آن عامل بسيار مهمي است. ژن FlaA يكي از پنج ژن كد كننده فلاژلين مي‎باشد كه نقش اصلي در حركت باكتري و كلونيزاسيون آن دارد و از نظر ايمني بخشي نيز مورد توجه مي‎باشد. در اين مطالعه كلونينگ و بيان ژن FlaA در باكتري اشرشياكلي و بيان پروتيين نوتركيب با روش وسترن بلات تاييد مي‎شود. مواد و روش‎ها: در اين مطالعه تجربي، ژن flaA با پرايمرهاي اختصاصي با PCR تكثير و با آنزيم‎هاي BamHI و XhoI در وكتور pTZ57R/T كلون و در E.coli سويهDH5? تكثير و تعيين توالي شد. در وكتور PGEX4T-1و در E.coli سويه BL21- DE3با القا IPTG بيان شد. از كيتG.S.T جهت خالص سازي پروتيين نوتركيب استفاده شد و پروتيين به موش تزريق و آنتي بادي اختصاصي سنتز شده در موش براي تاييد نهايي پروتيين نوتركيب در وسترن بلات مورد استفاده گرفت. يافته‎ها: تعيين توالي نشان داد كه ژن فوق بدرستي تكثير شده است و آنتي بادي استفاده شده در وسترن بلات، توليد پروتيين نو تركيب را نشان داد. نتيجه گيري: پروتيين نوتركيب flaA در ميزبان E.coli با مقدار مناسب بيان گرديد. تزريق پروتيين توليد شده به موش نشان داد كه اين پروتيين ضمن داشتن خاصيت آنتي ژني به خوبي آن را حفظ مي‎كند. بنابراين مي‎توان از آن به عنوان يكي از اجزا موثر در طراحي يك واكسن ايمني بخش و نيز به عنوان يك ابزار تشخيصي استفاد نمود. واژگان كليدي: اشرشياكلي، فلاژلين، بيان ژن، پروتيين نوتركيب، ويبريو كلره

Abstract Background: Vibrio cholera is an important agent causing cholera in human. The expression of Flagellum and the movement of the bacterium are critical in the colonization and virulence of Vibrio cholera. FlaA gene is one the five genes encoding Flagellin which plays an important role in the activity and movement of the bacterium and its colonization which has a significant role in its immunogenicity. The aim of this study was to express and produce the recombinant FlaA protein in E.coli using Western blot method. Materials and Methods: In this experimental study, FlaA gene was proliferated by PCR method using the specific primers and cloned with BamHI and Xhol in pTz57R/T. Then it was proliferated and sequenced in DH5a vector of E.coli. The cloned FlaA gene was inserted into pGEX-4T-1 vector. The cloned vector was transformed to BL21-DE3 of E. coli and successfully expressed by induction of IPTG. The expressed protein was purified by GST affinity resin. For preparation of the primary antibody, the purified recombinant protein was injected to rats. Western blot assay method was used for determining the antigenicity of the recombinant FlaA. Results: Determination of gene sequencing showed that this gene has been proliferated properly and the antibody used in Western blot verified the production of the recombinant protein. Conclusion: The results of this study demonstrate that FlaA protein is immunogenic and can be evaluated in vaccine designing and as a diagnostic tool for detection of cholera infection. Keywords: E. coli, FlaA, gene expression, recombinant protein, Vibrio cholera