بررسي پروتيين نوتركيب زير واحد A پيلي ويبريو كلرا در اشرشياكلي

A study of recombinant Vibrio cholera toxin-coregulated pili A (TCPA) from E.coli

چكيده زمينه و هدف: ويبريوكلرا يك باكتري پاتوژن گرم منفي است كه عامل بيماري اسهال است. يكي از مهم‎ترين عوامل بيماري‎زاي باكتري، پيلي هم تنظيم شونده با توكسين است. اين پيلي به عنوان اولين عامل در كلونيزاسيون و تداوم باكتري‎ها در روده كوچك مورد نياز است. مواد وروش‎ها: در اين تحقيق با استفاده از روش PCR، ژن پيلي هم تنظيم شونده با توكسين ويبريوكلرا تكثير گرديد. پس از تخليص، ژن‎هاي فوق در پلاسميد 1T4pGEX جهت بيان كلون شد. سپس ساختار پلاسميدي نوتركيب وارد باكتري اشريشياكلي شد. توليد پروتيين‎ها توسط IPTG القا و بهينه سازي شرايط محيط كشت صورت گرفت. پروتيين‎هاي نوتركيب با استفاده از كيت گلوتاتيون S سفاروز خالص و آزمايش وسترن بلات براي تاييد پروتيين نوتركيب انجام گرفت. ميزان پروتيين‎ها با استفاده از روش برادفورد اندازه‎گيري شد. يافته‎ها: نتايج تحقيق حاضر بيان موفقيت آميز پروتيين‎هاي نوتركيب در سلول اشرشياكلي را ثابت كرد. پروتيين نوتركيب به وسيله كروماتوگرافي تمايلي تخليص شد. الگوي واكنش اين پروتيين‎ها با آنتي‎بادي‎هاي ضد آنها، نشان داد كه اين پروتيين‎ها خاصيت آنتي‎ژنيك دارند. نتيجه‎گيري: از آنجا كه در اين مطالعه نشان داده شد، اين پروتيين‎ها داراي خاصيت آنتي ژنيسيته هستند، ممكن است به عنوان يك آنتي ژن مناسب براي واكسيناسيون باكتري ويبريوكلرا استفاده شود. واژگان كليدي: واكنش زنجيره‎اي پلي مراز، ژن پيلي هم تنظيم شونده با توكسينA ، ويبريو كلرا

Abstract Background: Vibrio cholerae is a gram-negative bacterial pathogen that causes diarrheal disease cholera. One of the most pathogenic factors of Vibrio cholera is pili. Pili plays an important role in colonization and persistence of bacteria in small intestine. Materials and Methods: In this study, pili A (tcpA) gene was amplified by Polymerase chain reaction (PCR) method and sub-cloned into expression vectors such as pGEX4T-1. Escherichia coli competent cells were transformed by recombinant plasmids and the expression of protein with IPTG. The recombinant proteins were purified by affinity chromatography (GST) and immunoblot analysis was used for evaluation of new recombinant proteins antigenicity. The concentration of recombinant proteins was measured according to Bradford assay. Results: The results of this study indicated that recombinant proteins were expressed successfully in competent cell of E. coli, such as E. coli BL21 (DH3). The recombinant protein was purified by affinity chromatography (GST). The immunoreactivity pattern of anti-Tcp antibody with recombinant proteins of TcPA showed that the recombinant proteins had antigenic properties. Conclusion: Because these recombinant proteins are antigenic, these proteins may be considered as tentative candidates for designing cholera vaccine. Keywords: Polymerase chain reaction (PCR), Toxin-coregulated pili (tcpA), Vibrio cholera