بيان نوتركيب و تخليص ناحيه 1 فاكتور كشنده باسيلوس آنتراسيس در Escherichia coli و توليد آنتي بادي پلي كلونال عليه آن در موش سوري

Recombinant expression and purification of Bacillus anthracis lethal factor domain 1 in Escherichia coli and production of polyclonal antibody against it in mice

چكيده زمينه و هدف: سياه‎زخم يك بيماري مشترك بين انسان و دام است. عامل ايجاد كننده بيماري، باكتري باسيلوس آنتراسيس مي‎باشد كه آنتي‎ژن حفاظت‎كننده و ناحيه يك فاكتور كشنده (LFD1) ايمونوژن‎هاي قوي اين باكتري بوده و همواره به عنوان كانديداي واكسن عليه باسيلوس آنتراسيس در نظر گرفته شده‎اند. هدف اين مطالعه بيان و تخليص LFD1 در باكتري Escherichia coli و توليد آنتي‎بادي پلي‎كلونال عليه آن در موش‎ سوري مي‎باشد. مواد و روش‎ها: در اين مطالعه تجربي، ژن LFD1 با جايگاه‎هاي برش آنزيمي BamHI و XhoI با واكنش PCR تكثير و بعد از جداسازي، در وكتور بياني pET28a(+) همسانه‎سازي گرديد. به منظور بيان ژن، اين وكتور به باكتري‎هاي صلاحيت‎دار E.coli-BL21(DE3)PLysS تراريخت شد. بيان ژن LFD1 تحت القايIPTG انجام و بعد از تخليص پروتيين با استفاده از كروماتوگرافي تمايلي، آنتي‎ژن حاصل در چهار نوبت به موش‎هاي سوري تزريق شد. آنتي‎بادي پلي‎كلونال توليد شده در سرم موش‎ها اندازه‎گيري گرديد. يافته‎ها: ژن LFD1 كلون شده در وكتور بياني pET28a(+) به وسيله PCR، هضم آنزيمي و توالي‎يابي تاييد شد. هم‎چنين پروتيين نوتركيب توليد شده به وسيله SDS-PAGE و لكه‎گذاري وسترن تاييد گرديد. در نهايت آنتي‎بادي پلي‎كلونال توليد شده از سرم موش‎ سوري جدا شده و به وسيله تست الايزا ارزيابي و تاييد گرديد. نتيجه‎گيري: با توجه به بيان مناسب، توليد آسان اين آنتي‎ژن و تيتر آنتي‎بادي پلي‎كلونال توليد شده عليه آنتي‎ژن LFD1 به دليل ايمونوژنيسيته آن در موش‎هاي سوري، مي‎توان آن را به عنوان كانديد واكسن عليه سياه‎زخم در نظر گرفت. واژگان‎كليدي: سياه‎زخم، باسيلوس آنتراسيس، ايمونوژن، آنتي‎بادي پلي‎كلونال

Abstract Background: Anthrax is a common disease among human and livestock which is caused by Bacillus anthracis. Bacillus anthracis has two strong immunogenic proteins: Protective antigen (PA) and lethal factor domain I (LFD1) that have always been considered as vaccine candidates against Bacillus anthracis. The aim of this study is to express and purify the lethal factor domain I (LFD1) in Escherichia coli and produce polyclonal antibody against it in mice. Materials and Methods: In this experimental study, LFD1 gene was amplified with BamH I and Xho I restriction site by PCR. After isolation, the gene was cloned to the expression vector pET28a (+). This vector was transformed to E. coli-BL21 (DE3) PLysSto to express LFD1 gene. The expression of LFD1 gene was induced by IPTG. After protein purification by affinity chromatography, the produced antigen was injected into mice for four times. Then the produced polyclonal antibody in mice serum was evaluated. Results: The cloned LFD1 gene in pET28a (+) vector was confirmed by PCR, enzymatic analysis, and sequencing. The expressed and purified recombinant protein was confirmed by SDS-PAGE and Western blotting. Finally, the isolated polyclonal antibody from mice serum was evaluated and confirmed by ELISA test. Conclusion: Noticing the appropriate expression, easy purification of LFD1, and the titer of produced polyclonal antibody against LFD1 in mice due to its immunogenicity, it can be considered as a good vaccine candidate against anthrax. Keywords: Anthrax, Bacillus anthracis, immunogen, polyclonal antibody