جداسازي قطعات مناطق متغير آنتي بادي تك زنجيره اي (scFv) عليه فاكتور نكروز دهنده تومور آلفا (TNF-?) از كتابخانه آنتي بادي فاژي

Isolation of Anti-Tumor Necrosis Factor-Alpha (TNF-α) scFvs Antibody from Phage Antibody Library

سابقه و هدف: سايتوكاين تراپي، يكي از راهكارهاي اصلي براي كنترل بيماري هاي التهابي شديد است. با توجه به اهميت TNF-? در بسياري از بيماري هاي التهابي و اتو ايميون، اين سايتوكاين يك هدف جذاب براي بسياري از محققين بوده و بعنوان يكي از كانديدهاي مهم براي سايتوكاين تراپي مطرح است. يكي از راهكارهاي مقابله با آثار زيانبار TNF-? استفاده از آنتي بادي هاي مونوكلونال است. يكي از تكنيك هاي مهم براي تهيه و توليد آنتي بادي هاي مونوكلونال تكنيك فاژ ديسپلي مي باشد. هدف از اين مطالعه تهيه و توليد آنتي بادي مونوكلونال بر ضد TNF-? مي باشد. مواد و روشها: بمنظور جداسازي قطعات كوچك نواحي متغير آنتي بادي (scFv) از كتابخانه فاژي Tomlinson تكنيكBiopanning با استفاده از پليت هاي الايزا انجام شد. پس از كوت نمودن پروتيين TNF-? در ته چاهك ها، كتابخانه فاژي اضافه شد. پس از مرحله شستشو، فاژهاي اختصاصي با استفاده از تريپسين جدا و در باكتري TG1 تكثير گرديد. اين پروسه جهت بدست آوردن فاژهاي نوتركيب بسيار اختصاصي تا پنج بار تكرار گرديد. ارزيابي كلون هاي بدست آمده حاوي قطعات كوچك آنتي بادي بر ضد TNF-? با استفاده از تست هاي مونوكلونال فاژ الايزا،PCR ، RFLP، توالي يابي و وسترن بلات انجام گرفت. يافته ها: تجزيه و تحليل توالي ها با استفاده از نرم افزار هاي بيوانفورماتيكي نشان داد كه پلاسميدهاي جدا شده از كلون هاي واكنشگر با TNF-? حاوي اينسرت بودند. بعلاوه تفاوت اين توالي ها بيشتر در سه منطقه دا،غ ديده مي شود كه مي تواند در فعاليت پروتيين تاثير گذارد. نتيجه گيري: نتايج مطالعه نشان داد كه با استفاده از تكنيك آنتي بادي فاژ ديسپلي آنتي بادي مونوكلونال نسل چهار بر ضد TNF-? با موفقيت توليد مي شود.

BACKGROUND AND OBJECTIVE: Cytokine therapy is a fundamental step for the control of the most severe inflammatory diseases. Considering the importance of TNF-? in most of autoimmune and inflammatory diseases, it has been as an attractive target for many researchers and is an important candidate for cytokine therapy. Using monoclonal antibodies is a major approach in contrast to deleterious effects of TNF-?. Antibody phage display technology is a major technique for the preparation of monoclonal antibodies. Our goal in current study was production and preparation of monoclonal antibody against TNF-?. METHODS: For Biopanning technique, we used ELISA plates for isolation of single chain variable fragments (scFv) from Tomlinson library. After coating of TNF-? protein in the wells, phage library was added. Specific phages were eluted using Trypsin after washing process and amplified in TG1 cells. Five rounds of panning were conducted for obtaining high specific phages. The evaluation of selected clones was done through monoclonal phage ELISA, PCR, RFLP and western blotting methods. FINDINGS: Analysis of sequences using bioinformatic softwares showed that separated plasmids from TNF-? reactive clones contained insertions. Furthermore, most of variations are seen in three hot regions which can affect protein function. CONCLUSION: The results of this study showed that forth generation of monoclonal antibodies against human TNF-? were successfully produced. KEY WORDS: Phage display, TNF-?, Monoclonal antibody, Single chain variable fragment.