بررسي تكثير ژن هاي VH و VL از منبع RNA تك پلاسماسل انساني

Amplification of VH and VL Gene Fragments from RNA Source of Single Human Plasma Cell

مقدمه و هدف: نخستين نسل آنتي بادي هاي درماني منوكلونال با منشا موشي موجب بر انگيختن پاسخ ايمونولوژيكي در بدن انسان مي شود. استفاده از آنتي بادي درماني كاملاً انساني علاوه بر كاهش ايمونوژنيسيته، بيشترين كارايي را به دنبال خواهد داشت. امروزه جهت تهيه آنتي بادي انساني تكنيك هاي‌ نمايش فاژي و روش‌هاي مبتني بر تك سلولB، مورد توجه قرار گرفته است. هدف از اين پژوهش تكثير ژن هاي VH و VL از منبع RNA پلاسماسل انساني مي باشد. روش كار: از واكنش RT-PCR به منظور جداسازي و تكثير قطعات ژن VH و VL از تك پلاسماسل غربالگري شده عليه آنتي ژن مورد نظر استفاده شد. در ابتدا با استفاده از بافر ليز كننده ي سلول، پلاسماسل ها ليز و جهت ساخت cDNA استفاده گرديدند. ژن هاي آنتي بادي انساني با استفاده از cDNA حاصل از يك پلاسماسل و مجموعه پرايمر هاي آنتي بادي تكثير و شش جفت پرايمر جهت تكثير نواحي متغير زنجيره سنگين (VH) و سبك (VL) مورد استفاده قرار گرفتند. در اين پرايمر ها جايگاه برش آنزيم هاي محدودالاثر جهت كلون نمودن در وكتور مربوطه و توالي لينكر جهت اتصال نواحي VH و VL قرار داده شد. يافته ها: الكتروفورز طي واكنشPCR مشخص نموده كه قطعات VH و VL به طول حدود bp400 به طور جداگانه تكثير يافته-اند. توالي هاي به دست آمده از ژن هاي آنتي بادي با ساير توالي هاي موجود در پايگاه NCBI مشابهت 97 درصدي نشان داد. نتيجه گيري: پرايمرهاي مورد استفاده در اين پژوهش به گونه اي طراحي شدند كه داراي توالي لينكر جهت تهيه ScFv و جايگاه برش آنزيم هاي NcoI و NotI جهت كلونينگ قطعات VH و VL هستند.

Inroduction & Objective: The first generation of therapeutic monoclonal antibodies was isolated from mouse. One of the disadvantages of them was stimulating immune response in human. Fully human monoclonal antibodies are significantly considered due to their high efficiency and low immunogenic potential. Nowadays different kind of techniques such as phage display and single B cell technology are used to produce fully human mAb. The aim of this project was amplification of VH and VL genes from RNA source of Human plasma cell. Materials and Methods: With the aim of isolation and amplification of VH and VL regions, single cell RT-PCR reaction was performed. Single plasma cells were lysed by using cell lysis buffer. By using synthesized cDNA from plasma cells and antibody specific primers, antibody genes were amplified. Six pair of primers utilized to amplify the variable region of heavy chain (VH) and light chain (VL). Restriction sites and the linker sequences were placed on primer sequences due to respectively cloned in target plasmid and to link VH and VL. Results: Electrophoresis represented VH and VL fragments with 400 bp length were amplified by PCR. The VH and VL gene sequences were BLAST separately and showed 97% similarity among other antibodies gene sequence. Conclusion: Primer sets were selected and designed which contain linker sequence for ScFv construction, NcoI and NotI restriction sites in order to clone directly into an expression vector. Key word: Human monoclonal antibody, ScFv, Plasma cell