طراحي كنترل داخلي به منظور تشخيص مايكوباكتريوم توبركيلوسيس در روش PCR

Design of an internal control (IC) for molecular diagnosis of Mycobacterium tuberculosis

سابقه و هدف: سل به عنوان دومين علت مرگ و مير ناشي از عفونت شناخته شده است. روش هاي مولكولي مانند PCR، تكنيك هاي مناسبي براي شناسايي مايكوباكتريوم توبركيلوسيس (MTB) هستند. بروز نتايج متفاوت در آزمايشگاه هاي مختلف، از معايب اين تكنيك مولكولي است. اين مطالعه با هدف طراحي، ساخت و كاربرد كنترل داخلي در روش PCR به منظور تشخيص MTB انجام شد. مواد و روش ها: به منظور ساخت كنترل داخلي ويژهMTB ، ابتدا پرايمرهاي ويژه آزمون PCR براي تشخيص مولكولي بهينه و سپس حساسيت و ويژگي آن مشخص گرديد. پرايمرهاي مركب (Composite Primer) براي IC-MTB نيز طراحي، تكثير و سپس كلون شد. IC-MTB تكثير شده در پلاسميد pTZ57R الحاق و در باكتري اشريشيا كلي JM107 ترانسفورم و كلون گرديد. تعداد حداقل IC در هر واكنش PCR از طريق رقيق سازي و همچنين طيف پاسخ PCR همراه با كنترل داخلي مورد بررسي قرار گرفت. يافته ها: اندازه محصول تشخيصي MTB با پرايمرهاي اختصاصي آن برابر با 245 جفت باز و محصول IC-MTB برابر با 660 جفت باز بود. كه از نظر اندازه، اختلاف مطلوب را با هم دارند. تعداد حداقل IC در هر واكنش 1000 عدد تعيين شد. حداقل و حداكثر حساسيت روش PCR همراه با IC براي DNA باكتري مايكوباكتريوم توبركيلوسيس بين 10 ميليون تا 10 باكتري محاسبه گرديد. در ارزيابي ويژگي با عوامل مختلف نيز هيچ محصول ناخواسته اي مشاهده نشد. نتيجه گيري: استفاده از يك كنترل داخلي در روش PCR مي تواند خطاها را در آزمون تشخيص مولكولي مايكوباكتريوم توبركيلوسيس شناسايي نمايد. در واقع تكثير IC نشان دهنده انجام صحيح تمامي مراحل تكثير و تشخيص مي باشد. Background & Objectives: Tuberculosis is the second reason of deaths caused by known infectious agents. Although molecular approaches, such as PCR, are suitable techniques for detection of Mycobacterium tuberculosis (MTB), these techniques suffer of variable results in different laboratory conditions. This study aimed to design, manufacture and apply an internal PCR control used for detection of MTB. Materials & Methods: To produce special MTB internal control, first individual PCR test primers was optimized for molecular detection of MTB, and then their sensitivity and specificity were measured. The composite primer for IC-MTB was also designed, replicated and colonized. The amplified IC-MTB was ligated to pTZ57R plasmid and was transformed into E. coli JM107. The minimum IC number in each PCR reaction was studied using dilution and PCR response spectrum with IC. Results: The size of MTB diagnostic products with individual primers and IC-MTB were was 245 bp and 660 bp, respectively, which is a suitable difference in the size aspect. Minimum IC number was identified 1000 for each reaction. Minimum and maximum sensitivity PCR test by IC for MTB DNA was determined 10 and 10 million bacteria, respectively. No unwanted products were observed in characteristic tests by different agents. Conclusion: Using an internal control as an inside control system we could detect the errors in MTB molecular diagnosis test. In fact, IC amplification is representative of correct procedure in amplification and detection steps.