تشخيص سريع موتاسيون در ژن عامل مقاومت به ريفابوتين در سويه هاي كلينيكي مايكوباكتريوم توبركلوزيس به روش Allele Specific PCR

Rapid Detection of Mutation in Gene Resistant to Rifabutin in Mycobacterium tuberculosis Isolates Using Allele Specific-PCR

سابقه و هدف: تشخيص مولكولی مقاومت در آنتی بيوتيك‌های موثر روی سويه‌های كلينيكی مايكوباكتريوم توبركلوزيس از اهميت ويژه‌ای برخوردار است. در اين مطالعه طراحی روشی جهت تشخيص سريع موتاسيون‌های مرتبط به مقاومت در ژن عامل مقاومت به آنتی بيوتيك ريفابوتين مورد بررسی قرار گرفت. مواد و روش‌ها: 40 سويه كلينيكی مايكوباكتريوم توبركلوزيس شامل 12 سويه مقاوم به ريفابوتين و28سويه حساس به اين آنتی‌بيوتيك مورد استفاده قرار گرفتند كه نمونه‌ها از بانك ميكروبی مركز تحقيقات سل و عفونی كودكان دانشگاه علوم پزشكی اراك اخذ شد. پرايمرهای اختصاصی با كمك نرم افزارهای BLAST، IDT و MEGA طراحی و تصحيح شدند. پرايمرهای طراحی شده جهت واكنش Allele Specific PCR از ´3 قابليت اتصال به نوكلئوتيدهای موتانت در كدون‌های 516-526-531 ژن rpoB را داشته و قابليت شناسايی حالت موتانت را داشتند، لذا عدم تشكيل باند در محصول PCR به معنی مقاوم بودن سويه به ريفابوتين بود. قطعه مورد نظر در تعدادی از نمونه‌ها تعيين ترادف شده و با نتايج به‌دست آمده مقايسه گرديد. يافته‌ها: از 12 سويه مقاوم به ريفابوتين مايكوباكتريوم توبركلوزيس با كمك روش Allele Specific PCR مورد مطالعه،10 سويه به عنوان سويه‌های موتانت در يكی از 3كدون اصلی تشخيص داده شدند. سويه‌های حساس نيز فاقد موتاسيون در اين كدون‌ها بودند. حساسيت روش معادل80 درصد با 95% CI:0.55-0.95 و ويژگی آن معادل 100 درصد با 95% CI:0/87-1 محاسبه گرديد. نتايج تعيين ترادف (سكوئنس) مؤيد نتايج به دست آمده بود. استنتاج: نتايج مطالعه حاضر نشان می‌دهد كه Allele Specific PCR روشی ساده و سريع برای تشخيص سريع مقاومت به ريفابوتين در سويه‌های كلينيكی مايكوباكتريوم توبركلوزيس بوده و جهت استفاده روتين پيشنهاد می‌شود.

Background and purpose: Molecular detection of antibiotic resistance in clinical strains of M.tuberculosis is of great importance. In this study, we developed a method for rapid detection of mutations resistant to the rifabutin antibiotic resistant gene. Material and methods: In this study 40 clinical isolates of M.tuberculosis including 12 resistant and 28 susceptible isolates to rifabutin were used. The isolates were obtained from Tuberculosis and Pediatric Infectious Research Center affiliated to Arak University of Medical Sciences. Specific primers were designed and corrected by BLAST-IDT and MEGA software. The primers for an Allele Specific PCR was able to detect the desired hot point in the gene from 3´end in 516-526-531 codons and could also reconnoiter mutant state; Therefore, lack of formation of band in PCR product indicates the resistance of strain to rifabutin. Some selected samples were sequenced and compared with results derived from ASP. Results: 12 M.tuberculosis isolates resistant to rifabutin, mutations in one of the three main codons were detected in 10 strains using Allele Specific PCR method. Susceptible strains did not show any mutations in these codons. The sensitivity of the method was 80% (95% CI: 0.55-0.95) and the specificity was 100% (95% CI:0.87-1). Results of sequencing were concordant with results of ASP method. Conclusion: The results showed that Allele Specific-PCR was a rapid and simple method for fast detection of rifabutin resistance in M.tuberculosis isolates and is recommended for routine works.