طراحي و ساخت كلون بيان كننده داروي ضد انعقادي دسيرودين (هيرودين) به شكل خارج سلولي در اشرشيا كلي

Designing and Constructing Clone for Extracellular Expression of the Desirudin Anticoagulant Drug in E.coli

سابقه و هدف: هيرودين پلی پپتيدی با 65 تا 66 اسيد آمينه است كه به عنوان داروی ضدانعقادی، از غدد بزاقی زالو ترشح می‌شود. اين دارو، مهاركننده بسيار قوی ترومبين می‌باشد بنابراين می‌تواند رقيبی برای هپارين نيز باشد. هدف از اين مطالعه، الحاق توالی سيگنال پپتيد pelB (توالی سيگنال پپتيد pelB روی سكانس پلاسميد pET-22b تعبيه شده است) و بررسی بيان پروتئين نوتركيب هيرودين در اشرشياكلی می‌باشد. مواد و روش‌ها: ترادف 66 آمينواسيدی واريانت HV3 ژن هيرودين تهيه و به داخل يك وكتور بيانی قوی (pET-22b) انتقال داده شد. برای تسهيل در تخليص پروتئين از His-tag در ناحيه N-ترمينال ژن استفاده گرديد. سيگنال پپتيد pelB در ابتدای ژن با هدف ترشح به فضای پری پلاسميك و محيط كشت درج شد و ساختار پلاسميدی حاصله توسط سويه OrigamiB (DE3) باكتری E.coli بيان شد. در نهايت ميزان بيان پروتئين توليدی در ناحيه سيتوپلاسم، فضای پری پلاسمی و محيط كشت مقايسه گرديد. يافته‌ها: نتايج به‌دست آمده نشان می‌دهد كه مقدار پروتئين بيشتری در فضای پری پلاسميك بيان شده و مقدار كمی پروتئين نيز به محيط كشت ترشح گرديده است. استنتاج: با به كارگرفتن وكتورهايی كه قادر به انتقال پروتئين هدف به فضای پری پلاسميك، كه محيطی بسيار مطلوب برای شكل‌گيری باندهای دی سولفيد و فلدينگ صحيح پروتئين هدف هستند، احتمال تشكيل اينكلوژن بادی‌ها كاهش يافته و توليد پروتئين‌های محلول و فعال افزايش می‌يابد.

Background and purpose: Hirudin is a 65-66 amino acids polypeptide which is secreted as an anticoagulant compound from salivary glands of medical leech. This drug is a very potent inhibitor of thrombin and is so effective for arterial and venous thrombosis prevention. Therefore, it can compete with heparin. The aim of this study was to add a pelB signal peptide to pET-22b plasmid and to investigate the expression of recombinant hirudin in E.coli. Materials and methods: At first, the 66 nucleotic sequence of hirudinʹs gene was obtained and entered to a powerful vector (pET-22b). N_terminal His-tag was used for protein purification. We inserted pelB signal sequence at the begining of the gene to secrete protein to periplasmic region and culture medium. The expression of the target protein by origami (DE3) strain was then measured. Finally, the target protein was measured in periplasmic region, cytoplasm and culture medium. Results: The results showed that more protein was expressed in the periplasmic space and a small amount of protein secreted into the culture medium. Conclusion: Using the vectors capable of transferring the proteins to the periplasmic region, that is very favorable space for the formation of disulfide bonds and properly folding of the target protein, could decrease the production of inclusion bodies and increase the production of soluble and active proteins