شناسايي گونه هاي آسپرژيلوسي با كاربرد تك آنزيم محدودساز MwoI در روش RFLP مبتني بر آمپليفيكاسيون ناحيه ژني rDNA

Identification of Aspergillus species using a single restriction enzyme MwoI in RFLP method based on the amplification of rDNA gene.

مقدمه: گونه هاي آسپرژيلوس بعضاً با بيماريهاي انسان مرتبط هستند. يافتن يك روش دقيق و سريع براي شناسايي اين قارچها اهميت ويژه-اي دارد و مي تواند در غربالگري بيماري و اهداف اپيدميولوژيك موثر باشد. مواد و روش ها: نمونه هاي ما شامل گونه هاي مختلف آسپرژيلوسي از نمونه هاي باليني و محيطي چهار بيمارستان آموزشي بودند. آسپرژيلوس ها ابتدا با روش مورفولوژيك شناسايي شدند. توده هاي ميسليومي آسپرژيلوسي از كشت هاي سابورود براث استخراج شده براي استخراجDNA به روش فنل كلروفرم- گلاسبيد مورد استفاده قرار گرفتند. آمپليفيكاسيون ژن rDNA با استفاده از پرايمر هاي يونيورسال ناحيه ITS انجام شد و محصولات واكنش زنجيره اي قابل هضم با آنزيم محدودساز MwoI با استفاده از روش PCR- RFLP مورد تفكيك قرار گرفتند. بحث و نتيجه گيري: روش PCR-RFLP مبتني بر ژن DNA ريبوزومي، براي تعيين گونه هاي آسپرژيلوسي مورد استفاده قرار گرفت. كاربرد آنزيم محدودساز MwoIما را قادر نمود كه بيشترين افتراق را در بين گونه هاي آسپرژيلوسي ايجاد نماييم و گونه هاي مهم آسپرژيلوسي را در مدت زمان كوتاهي شناسايي كنيم. يافته ها: ما موفق به شناسايي هشت گونه مهم آسپرژيلوس شامل: آسپرژيلوس فلاووس، آسپرژيلوس نايجر، آسپرژيلوس فوميگاتوس، آسپرژيلوس تريوس، آسپرژيلوس كلاواتوس، آسپرژيلوس اكراسيوس، آسپرژيلوس آمستلوييدامي و آسپرژيلوس نيدولانس با كاربرد روش مولكولي آزمون شديم. شناسايي و افتراق مهمترين گونه هاي آسپرژيلوس بدست آمده از كشت كوتاه مدت 36 ساعته و استفاده از پروفايل معرفي شده شامل استخراج DNA، PCR و هضم آنزيمي براي تقريباً تمام نمونه هاي آزمون شده زماني در حدود يك روز كاري نياز داشت.

Background: Aspergillus species are occasionally associated with human infections. It is essential to find a rapid and reliable method to identify these fungi and can be useful for screening the disease and also epidemiological aims. Materials and Methods: Our subjects included Aspergillus species isolated from clinical and environmental sources of four Iranian educational hospitals. Aspergilli were primarily identified using morphological methods in the level of species. Aspergillus mycelia were harvested from sabouraud broth media and the used for the DNA extraction by Glass beads-Phenol Chloroform method. Ribosomal DNA gene was amplified using the universal primers of ITS. The resulted PCR products were subjected to a digestion with a novel restriction enzyme, MwoI in RFLP method. Results: We could identify eight important species of Aspergillus including: A. flavus, A. fumigatus, A. niger, A. terreus, A. clavatus, A. nidulans, A. ochraceus, A. amsteloidami using tested molecular method. The identification of Aspergillus species was carried out using a protocol including, extraction, PCR and RFLP in a short time 36 hour culture . Conclusion: The method of the PCR-RFLP based on ribosomal DNA gene with the novel restriction enzyme, MwoI enabled us to identify the most medically important Aspergillus species in a short time.