ساخت كتابخانه ژني آنتي‌بادي ScFv انساني بر پايه T Vector عليه توكسين كزاز

Creating a human ScFv antibody library based on T-Vector against tetanus toxin

سابقه و هدف: امروزه آنتي‌بادي‌ها‌ در حوزه‌هاي تشخيص و درمان جايگاه ويژه‌اي را به خود اختصاص داده‌اند. در اين‌ ميان، آنتي‌بادي‌هاي مونوكلونال كاملاً انساني به دليل عدم برانگيختن پاسخ ايمني در بدن و كارايي بالا در درمان بيماري‌ها مورد توجه قرار‌گرفته‌اند. تحقيق پيش‌رو به‌منظور ساخت كتابخانه ژني آنتي‌بادي نوتركيب انساني از يك فرد واكسينه با توكسوييد كزاز انجام گرفته است. مواد و روش‌ها: ابتدا از فرد ايمن با توكسوييد كزاز خون گرفته شد. سپس لنفوسيت‌ها جدا و RNA از آن ها استخراج گرديد. همه تنوع ژن‌هاي ناحيه متغير زنجيره‌هاي سبك و سنگين آنتي‌بادي به روش RT-PCR تكثير و به صورت ScFv به يكديگر متصل شدند. سپس اين قطعات به داخلT vector الحاق و به باكتريE. coli DH5? انتقال يافتند. پس از آن، الايزا صورت گرفت. جهت تاييد كتابخانه ژني آنتي‌بادي، پلاسميد آن استخراج و توالي‌يابي انجام شد. يافته ها: كيفيت cDNA با انجام واكنش توسط پرايمرهاي ژن HPRT تاييد شد. صحت انجام مراحل PCR و كلونينگ، توسط الكتروفورز ژل ‌آگارز و برش آنزيمي مورد تاييد قرار‌گرفت. باكتري‌هاي حاوي پلاسميد نوتركيب با رشد روي محيط كشت بر اساس رنگ آبي و سفيد، مشخص شدند. از كلون‌ها پلاسميد استخراج و توالي‌يابي انجام شد. نتايج حاصل از تشابه توالي‌ها در پايگاه داده ي igblast نشان داد كه اين توالي‌ها مربوط به ژن آنتي‌بادي انساني مي‌باشند. هم چنين توسط الايزا تاييد اين كه آنتي بادي اختصاصي توكسين كزاز مي باشد، صورت گرفت. نتيجه گيري: در اين تحقيق كتابخانه آنتي‌بادي انساني از فرد ايمن با توكسوييد كزاز، ساخته شد. سپس، ژن آنتي بادي موجود در اين كتابخانه توسط توالي يابي و هم ترازي در پايگاه NCBIمورد تاييد قرار گرفت و الايزا اختصاصيت اين آنتي بادي ها را مشخص نمود. در‌ ادامه جهت يافتن ژن آنتي‌با‌دي‌ اختصاصي توكسين‌كزاز در اين كتابخانه، لازم است غربال گري به روش نمايش ‌فاژي انجام‌ شود.

Aims and Background: Nowadays, monoclonal antibodies (mAbs) became powerful therapeutic and diagnostic tools. Due to showing minimum immunogenic reaction and their properties, human mAbs are important. The purpose of this study was to construct an immune antibody library from a vaccinated donor against tetanus toxin. Materials and Methods: A whole blood sample was taken from the donor who was vaccinated against tetanus toxoid. PBMC were isolated by using ficol. After RNA extraction, all variation of VH and VL regions by RT-PCR reactions were amplified and linked as a ScFv antibody. The amplicons were inserted in T-vector and transformed to E. coli DH5? strain, followed by an ELISA test. Plasmids were also extracted and sequenced. Results: cDNA quality was confirmed by using HPRT primers. To confirm PCR, insertion and transformation, gel electrophoresis and restriction enzymes digestion were applied. Positive clones were selected based on growth on LB agar which is the blue/white selection method. After plasmid extraction and DNA sequencing, the sequences were aligned using igBLAST at NCBI. The result was shown to have admissible similarity among antibody gene library nucleotide sequences and the antibody genes were deposited in this database. ELISA confirmed this data too. Conclusion: In this study, the immune human antibody library was constructed and confirmed using DNA sequencing and sequences alignment in NCBI database. ELISA test confirms antibody specifically. The next step is to screen the library to find an antibody specifically for tetanus toxin