تاثير نانورشته پلي اِل لاكتيك اسيد بر القا كلوني زايي سلول هاي اسپرماتوگوني منجمد يخ‌گشايي شده گوساله در محيط آزمايشگاه

The effect of poly L-lactic acid nanofiber on the induction of colony formation of frozen-thawed bovine spermatogonial stem cells in vitro

سابقه و هدف: ايجاد شرايط بهينه جهت كشت سلول هاي بنيادي اسپرماتوگوني در محيط آزمايشگاه، به كشف تمامي مكانيسم هاي مولكولي دخيل در اسپرماتوژنز و دستورزي در ژن ها كمك شاياني مي نمايد. هدف از انجام مطالعه ي حاضر بررسي تاثير داربست نانو-رشته پلي ال لاكتيك اسيد بر تكثير سلول هاي اسپرماتوگوني منجمد-يخ‌گشايي شده گوساله در محيط آزمايشگاه مي باشد. مواد و روش ها: استخراج و تخليص سلول ها از بيضه گوساله 3 تا 5 ماهه با روش هضم آنزيمي دو مرحله اي و حذف تمايزي صورت پذيرفت. سلول ها پس از انجماد و يخ گشايي در دو گروه مجزا كشت داده شدند: 1- گروه شاهد: كشت سلول‌ به صورت ساده 2- گروه تيمار: كشت سلول ها بر روي نانورشته. سلول ها در محيط كشت DMEM حاوي FBS 5 درصد و در حضور ng/ml GDNF40 به-مدت 2 هفته كشت داده شدند. ارزيابي كلوني هاي اسپرماتوگوني در روزهاي 4، 7، 10 و 13 كشت صورت پذيرفت. بيان ژن هاي (PLZF, GFR?-1, VASA, Itg?6, BCL6) با روش RT-PCR در روز پاياني كشت در تمامي گروه ها ارزيابي شد. نتايج: درصد حيات سلول ها پس از جداسازي و افزودن محلول انجماد به ترتيب 4/2±4/87 و 1/3±8/81 درصد بود كه پس از يخ گشايي اين ميزان به 7/1±65 درصد كاهش يافت (01/0P < ). مساحت كلوني هاي مشتق از اسپرماتوگوني گروه تيمار در مقايسه با گروه شاهد در روز 13 افزايش معني‌دار داشت (05/0P < ). در پايان كشت تمامي ژن هاي اختصاصي اسپرماتوگوني بيان شد. نتيجه گيري: آن گونه كه از نتايج حاصل از اين مطالعه برمي آيد نانورشته پلي ال لاكتيك اسيد، ريزمحيطي مناسب در جهت كشت سلول-هاي منجمد- ذوب شده اسپرماتوگوني در محيط آزمايشگاه فراهم مي آورد.

Background: Preparing a suitable condition for in vitro culture of spermatogonial stem cells can help discover all of the molecular mechanisms involving in spermatogenesis and pave the way for gene manipulation. This study aimed to evaluate the effect of a poly L-lactic acid (PLLA) nanofiber on the proliferation of frozen-thawed bovine spermatogonial stem cells in vitro. Materials and Methods: The isolated spermatogonial cells from the prepubertal bull were frozen-thawed and cultured in two groups: the control group (C) including the spermatogonial cells and the treatment group (T) including the spermatogonial cells seeded onto PLLA. The cells in both groups were cultured in DMEM supplemented with 5% fetal bovine serum and 40 ng/ml glial cell line-derived neurotropic factor (GDNF) for 2 weeks. Colony assay was conducted on days 4, 7, 10 and 13 after the beginning of the culture. Expression of spermatogonial genes (PLZF, BCL6, GFR?-1, VASA, Itg?6) in the culture was determined by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) on the last day of the experiment. Results: The viability rates of fresh cells before and after the addition of cryoprotectant agent were 87.4±2.4 and 81.8±3.1, respectively which decreased to 65±1.7 after the thawing (P < 0.01). Moreover, the results showed that the surface area of colonies derived from spermatogonia were significantly greater in the treatment group compared to the control group on day 13 (P < 0.05). Finally, RT-PCR revealed the expression of all spermatogonial stem cell (SSC) markers in both groups. Conclusion: The PLLA nanofiber can provide a suitable microenvironment for frozen-thawed SSCs in an in vitro-culture system.