جداسازي و شناسايي مايكوپلاسما آگالاكتيه(Mycoplasma agalactiae) با استفاده از دو روش كشت و واكنش زنجيره اي پليمراز(PCR) از شير گوسفندان منطقه ماسال(استان گيلان)

Isolation and identification of Mycoplasma agalactiae by culture and polymerase chain reaction (PCR) from milk of sheep in Masal, Guilan

سابقه و هدف: بيماري آگالاكسي واگيردار ((Contagious agalactiae، يك بيماري عفوني دامي در گوسفند و بز محسوب مي شود كه منجر به عفونت پستان، بيماري مفاصل زانو، كدورت قرنيه چشم و سقط جنين در دام مي گردد. مايكوپلاسما آگالاكتيه مهمترين عامل اين بيماري در گوسفند و بز مي باشد. هدف از اين تحقيق جداسازي و شناسايي مايكوپلاسما آگالاكتيه به كمك روش هاي تشخيصي كشت و PCR از شير گوسفندان مشكوك به بيماري، در منطقه ماسال از توابع استان گيلان بود. مواد و روش ها: در اين تحقيق از 5 گله گوسفندي كه علايم ظاهري بيماري را داشتند، 25 نمونه از ترشحات پستان اخذ شد كه پس از كشت در محيط PPLO broth ، DNA با استفاده از كيت Roche استخراج و مورد آزمون PCR قرار گرفتند. آزمون PCR بر روي نمونه هاي استخراجي با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي با محصولاتي به طول bp270 در ژن 16S rRNA براي جنس مايكوپلاسما و 375bp در ژن ليپوپروتيين براي گونه مايكوپلاسما آگالاكتيه انجام شد. يافته ها: از مجموع 25 نمونه كه ابتدا درمحيط Broth PPLO (جهت غني سازي و رشد) و سپس در محيط Agar PPLO جهت رشد و تشكيل پرگنه كشت داده شدند، تعداد 9 نمونه(36درصد) با تشكيل پرگنه، مثبت تشخيص داده شدند. در آزمون PCR جنس مايكوپلاسما، 17 نمونه(68درصد) مثبت با باند مشخص bp270 و تعداد 5 نمونه(4/29درصد) با باند مشخصbp375 در آزمون PCR گونه مايكوپلاسما آگالاكتيه، مثبت گزارش شدند. از مجموع 25 نمونه دريافتي تعداد 8 نمونه در دو روش كشت و PCR مثبت، تعداد 7 نمونه در هر دو روش منفي، تعداد 1 نمونه كشت مثبت و PCR منفي و تعداد 9 نمونه PCR مثبت و كشت منفي شدند. نتيجه گيري: نتايج حاصله نشان داد كه PCRبعنوان روش جايگزين مطميني براي كشت، در جداسازي و شناسايي مايكوپلاسما اگالاكتيه قابل استفاده مي باشد. مايكوپلاسما آگالاكتيه براي نخستين بار از موارد مشكوك به بيماري از شير گوسفندان منطقه ماسال گيلان جداسازي شد كه بعنوان مهمترين عامل آگالاكسي در اين منطقه شناخته نشد.

Aim and Background: Contagious agalactiae (C.A) is a serious disease syndrome of sheep and goat characterized by mastitis and subsequent failure of milk production, arthritis, abortion and kerato-conjunctivitis. Mycoplasma agalactiae (M. agalactiae) is the main cause of the disease in sheep and goat. The aim of this study was isolation and identification of M. agalactiae with culture and polymerase chain reaction (PCR) assay from milk of sheep in Masal, Iran Material and Methods: A total of 25 samples were collected from milk secretion of sheep. All samples were cultured in PPLO broth supplemented for M. agalactiae isolation. The bacteria DNAs were extracted by High Pure PCR Template Preparation kit and the PCR assay was applied for the detection of Mycoplasma genus in 270bp fragment in 16S rRNA gene and M. agalactiae in 375bp fragment in lipoprotein gene from culture as well as clinical samples. Results: Of the 25 samples, 9 (36%) yielded one of the potentially pathogenic Mycoplasmas evaluated for using PPLO agar culture diagnostic method, and 17 (68%) yielded one of the potentially pathogenic Mycoplasmas evaluated for using Mycoplasma genus PCR as diagnostic method, and 5 (29/4%) of the samples yielded M. agalactiae by using M. agalactiae PCR as diagnostic method. Of the 25 samples, 8 samples were culture positive and PCR positive, 7 samples were culture negative and PCR negative; whereas 9 samples were culture negative and PCR positive and only one sample was culture positive and PCR negative. Conclusion: The result showed that PCR can be used as an alternative method instead of culturing to identify M. agalactiae. M. agalactiae was detected for the first time from milk of sheep in Masal, Iran and it was not the main factor of C.A there.