شناسايي و تعيين هويت مولكولي ايزوله‌ هاي كوكسي گرم مثبت عامل استرپتوكوكوزيس جدا ‌شده از ماهيان قزل آلاي رنگين‌كمان در استان مركزي

MOLECULAR DETECTION AND IDENTIFICATION OF GRAM-POSITIVE COCCI, STREPTOCOCCOSIS AGENT ISOLATED FROM RAINBOW TROUTIN MARKAZI PROVINCE

سابقه و هدف: يكي ازمهم ترين بيماري ‌هاي ماهيان پرورشي به خصوص قزل آلا بيماري استرپتوكوكوزيس است كه مي تواند باعث مرگ و مير تعداد زيادي از ماهيان شده و خسارات سنگيني به مراكز پرورش ماهي وارد كند. در اين تحقيق جهت شناسايي و تعيين هويت دقيق و مطمين ايزوله‌ هاي كوكسي گرم مثبت عامل استرپتوكوكوزيس از روش PCR و تعيين توالي استفاده شده است. مواد و روش‌ها: طي بهار و تابستان 1390 از 12 مزرعه استان مركزي نمونه برداري به عمل آمد. از هر مزرعه تعداد 10 عدد ماهي در حال مرگ يا داراي علايم كلينيكي انتخاب گرديد. نمونه ‌ها در محيط بلاد آگار كشت داده شد و به مدت72 ساعت در دماي37درجه سانتي گراد انكوبه گرديد. سپس آزمايشات متداول ميكروبيولوژي براي تاييد نمونه هاي مشكوك به استرپتوكوكوزيس صورت گرفت. جهت تعيين نوع آنتي ‌بيوتيك موثر بر باكتري‌ هاي شناخته شده آزمون آنتي‌ بيوگرام با روش ديسك ديفيوژن انجام شد. كليه نمونه‌ هاي مثبت ميكروبي مورد آزمايش PCR و تعيين توالي قرار گرفتند. يافته ها: در اين طرح12 جدايه كوكسي گرم مثبت از بافت هاي كليه، مغز، كبد و طحال120 ماهي قزل آلاي بيمارتوسط آزمايشات ميكروبيولوژي جدا سازي شد. تمامي نمونه ‌هاي مثبت ميكروبي در آزمايش PCR (براساس ژن16SrRNA) مثبت تشخيص داده شد واين كوكسي‌ هاي گرم مثبت پس از تعين توالي به عنوان لاكتوكوكوس گارويه شناسايي شدند و با استفاده از آنتي‌ بيوگرام نمونه‌ ها، مقاومت آن ‌ها به كوليستين، لينكومايسين، كلوگزاسيلين، استرپتومايسين، ناليديكسيك‌ اسيد تاييد شد. نتيجه گيري: لاكتوكوكوس‌ گارويه يكي از عوامل اصلي بيماري استربتوكوكوزيس شايع در استان مركزي است.

Aims and Background: Streptococcosis is one of the most important diseases of the farmed fishes specially, rainbow trout, causing the death of many fishes and also leading to heavy damages on aquaculture centers. This research deals with the exact recognition and determination of Gram-positive cocci isolates (Streptococcosis agent), using PCR and sequencing analysis. Materials and Methods: the sampling was performed during spring and summer 2011 from 12 farms of Markazi province and 10 fish were? selected with death-sick or clinical signs from each farm. Firstly the samples were cultivated in blood agar and incubated for 72 hours in 37?C, then the conventional microbiology experiments were conducted on the suspected samples to confirm Streptococcosis disease. Also antibiogram test was carried out using disk diffusion method to determine the effective antibiotic type on known bacteria. All the positive microbial samples were subjected to PCR and sequencing experiments. Results: In this research, 12 isolates of Gram-positive cocci were separated from kidney, brain, liver and spleen of 120 rainbow trout patients by microbiological and some biochemical tests. All positive microbial samples in PCR test (based on 16SrRNA gene) were recognized positive and determined as Lactococcus garvieae based on sequencing analysis. The resistance of gram-positive cocci to colistin, lincomycin, cloxacillin, streptomycin and nalidixic acid were shown on antibiograms disk diffusion experiment. Conclusion: Lactococcus garvieae is major gram-positive cocci in infected fish farms in Markazi province.