كلونينگ و بيان ژن drRRA باكتري داينوكوكوس راديودورانس در اشريشيا كلي سويه Origami

Cloning and expression of Deinococcus radiodurans drRRA gene in E. coli Origami strain

سابقه و هدف: داينوكوكوس راديودورانس يكي از باكتري هاي مقاوم به پرتو است و مي تواند در محيط هاي راديو اكتيو كه ساير موجودات قادر به رشد در آن نيستند، به حيات خود ادامه دهد. مطالعات نشان مي دهد كه چندين پروتيين آنتي اكسيدان و ترميم كننده DNA در مقاومت بخشي آن نسبت به پرتو نقش دارند. پروتيين DrRRA يكي از پروتيين هاي تنظيمي مهم داينوكوكوس راديودورانس در مقاومت بخشي به پرتو است. هدف از اين مطالعه كلونينگ و بيان ژن drRRA در اشريشيا كلي بوده است. مواد و روش ها: ژن drRRA داينوكوكوس راديودورانس بصورت سنتتيك در وكتور pGEM-B1 ساخته شد و به دنبال آن در وكتور بياني pET21a ساب كلون شد. براي تاييد ساب كلونينگ، هضم آنزيمي و توالي يابي انجام شد. براي تاييد بيان ژن drRRA در اشريشيا كلي سويه Origami، ژل الكتروفورز پلي اكريل آميد و وسترن بلاتينگ انجام شد. يافته ها: پلاسميد pET21a حاوي ژن drRRA به همراه برچسب هيستيديني در قسمت C-ترمينال بطور موفقيت آميز ساخته شد. همچنين، پروتيين نوتركيب DrRRA بصورت داخل سلولي در اشريشيا كلي ترانسفورم شده توليد شد. نتيجه گيري: نتايج اين مطالعه نشان داد كه ساب كلونينگ و بيان ژن drRRA در ميزبان اشريشيا كلي امكان پذير مي باشد، همچنين، ميزان بيان پروتيين هدف مناسب بوده و مي توان مقاومت بخشي پروتيين DrRRA را به پرتو در سيستم هاي پروكاريوتي و يوكاريوتي نيز بررسي كرد.

Aim and Background: Deinococcus radiodurans is one of the most radio resistant microorganisms able to survive in an extreme environment. Available data show that multiple DNA repair and antioxidant proteins are involved in radio resistance. DrRRA is a novel response regulator essential for the radio resistant of Deinococcus radiodurans. The aim of this study was cloning and expression of drRRA gene in E. coli system. Material and methods: The drRRA gene of Deinococcus radiodurans was synthesized in pGEM-B1 vector and the synthetic gene was subcloned to pET21a expression vector. Subcloning of the gene was verified by double digestion and sequencing. The cloned gene was expressed in E. coli (Origami strain). Expression of recombinant DrRRA (rDrRRA) was confirmed by polyacrylamide gel electrophoresis and Western blotting. Results: The chimeric pET21a plasmid containing the C-terminal fusion of His-tag with DrRRA was successfully constructed. Recombinant DrRRA was intracellularly produced by transformed E. coli. Conclusion: The results of this study indicated that subcloning and expression of drRRA gene in E. coli is feasible. In addition, the expression level of protein was suitable and it should be analyzed in prokaryotic and eukaryotic systems.