بيان پروتيين نوتركيب اينترفرون گاما در بذر گياه توتون

Expression of recombinant gamma interferon in tobacco plant seeds

از مهم ترين عوامل موثر بر افزايش توليد پروتيين نوتركيب در گياه، بيان آن در بافت مناسب و نيز افزايش پايداري و تجمع پروتيين با استفاده از عوامل هدف گيري كننده به جايگاه هاي مناسب سلول است. در اين تحقيق براي بيان اينترفرون گاماي انساني در بذر توتون و هدايت آن به شبكه آندوپلاسمي از پيشبرنده اختصاصي بذر (Napin)، توالي كوزاك در انتهاي ʹ5 و توالي KDEL در انتهاي ʹ3 ژن IFN? استفاده شد. ژن IFN? ابتدا در ناقل pGEM®-T Easy همسانه سازي و پس از تاييد صحت آن با استفاده از روش PCR، هضم آنزيمي و توالي يابي، در ناقل بياني گياهي pBI121 زير همسانه سازي گرديد. ناقل نوتركيب pBI IFN? به سويه LBA4404 اگرباكتريوم معرفي و اين باكتري براي تراريختي ريزنمونه هاي برگي توتون استفاده شد. نوساقه هاي باززايي شده در محيط انتخابي حاوي كانامايسين گزينش شدند. آناليز گياهان تراريخت در سطح DNA و مشاهده قطعه 432 جفت بازي IFN?)) و قطعه 795 جفت بازي (NPTII) در واكنش PCR و هضم آنزيمي بيانگر انتقال سازه مدنظر به ژنوم گياه بود. همچنين رونويسي از ژن IFN? با RT-PCR تاييد شد. بررسي ها در سطح پروتيين با استفاده از SDS-PAGE بيان موفقيت آميز ژن IFN? را نشان داد. نتايج حاصل نشان مي دهد كه بذور گياهي پتانسيل بالايي براي توليد پروتيين هاي نوتركيب دارند.

Some important strategies to increase recombinant protein yield in plants include expression of protein in suitable tissue, improvement of protein stability and accumulation by targeting into subcellular organs using specific targeting signals. In this perspective, seed-based platforms are attractive because they allow recombinant proteins to stably accumulate at a relatively high concentration in a compact biomass, which is beneficial for extraction and downstream processing. On the other hand, the ER contain chaperons and isomerase for folding of nascent proteins, which can promote correct protein folding leading to recombinant protein stability and accumulation. In this research for human Gamma interferon expression in tobacco seeds and targeting into ER, we used seed specific promoter (Napin), Kozak sequence at 5ʹ end and KDEL sequence in 3ʹ end of the IFN? gene. The fragment was cloned into pGEM®-T Easy vector and after confirmation by PCR, restriction enzyme analysis and sequencing, was subcloned into a plant binary vector (pBI121). This construct cassette was transferred to A.tumefaciens LBA4404 and then used to transform tobacco explants. The transformed plants were screened on antibiotic-contained media. The presence of the transgenes was confirmed in the transformants by PCR and expected 432bp (IFN?) and 795bp (nptII) sequences were amplified. Digestion result indicated that the mentioned construct completely and correctly transferred into tobacco genome. Transcription of IFN? gene was confirmed by RT-PCR. Analysis of transgenic plants by SDS-PAGE represented that IFN? protein is being expressed in seeds. Our results indicate that plant seeds have potential for production of recombinant proteins as ‘natural bioreactors’.