كلونينگ و بيان ژن غير ساختاري 3ABC ويروس تب برفكي سروتايپ Oدر باكتري اشرشياكلي

Cloning and expression of non-structural 3ABC gene from FMD virus serotype O in Escherichia coli

بيماري تب برفكي اولين بيماري ويروسي شناخته شده در حيوانات است كه با گذشت بيش از صد سال از شناخت آن، همچنان يكي از مهمترين خطراتي است كه صنعت دامپروري دنيا را تهديد مي‌نمايد. يكي از مهمترين روش هاي شناسايي حيوان واكسينه شده از حيوان مبتلا به تب برفكي استفاده از پروتيين غيرساختاري 3ABCبه عنوان آنتي ژن در كيت الايزا مي باشد. از اين رو، ژن 3ABC ويروس تب برفكي سروتايپ Oبا استفاده از واكنش زنجيره پليمراز و پرايمرهاي اختصاصي حاوي سايت هاي برشي BamHI و HinDIII جداسازي شد. به منظور بررسي خصوصيات نوكلوتيدي، ژن تكثير شده به ناقل pTZ57R/T انتقال و حضور ژن هدف در ناقل كلونينگ pTZ57R/T با استفاده از روش هاي كلوني PCR، هضم آنزيمي و توالي يابي تاييد شد. به منظور توليد آنتي ژن نوتركيب، ژن هدف به ناقل بياني pET21a (+) وارد و سپس به باكتري اشرشياكلي BL21(DE3) به عنوان ميزبان بيان منتقل شد. باكتري حاوي ناقل نوتركيب با استفاده از IPTG در غلظت نهايي5/1 ميلي مولار القا شد. توليد پروتيين نوتركيب با استفاده از الكتروفورز پروتيين و وسترن بلاتينگ تاييد شد. وزن مولكولي پروتيين توليد شده در حدود 50 كيلودالتون مشخص شد. نتايج نشان داد كه از پروتيين نوتركيب توليد شده مي توان به خوبي به عنوان آنتي ژن در كيت تشخيصي الايزا براي حيوانات استفاده شود.

After about one hundred year after its identification, Foot and Mouth Disease (FMD) is the first viral disease in animals that impose a major risk to the worldʹs livestock industry. The main method to identify animals vaccinated from animals infected with FMD is using of non-structural 3ABC protein as antigen in the ELISA kit. Hence, 3ABC gene of FMDV serotype O was isolated with PCR using specific primers containing BamHI and HinDIII restriction sites. The isolated fragment was then inserted in pTZ57R/T vector for cloning and nucleotide characterization. In order to produce recombinant antigens, 3ABC was inserted in pET21a (+) vector and then transform to E. coli BL21 (DE3). Recombinant protein production was induced with 1.5 mM IPTG. Production of recombinant proteins confirmed with SDS electrophoresis and Western blotting. The molecular weight of recombinant protein was determined approximately 50 kDa. The results showed that the produced protein can be used as an antigen in the ELISA kit for animals.