تمايز عصبي سلول هاي كار سينوماي جنيني P19 بيان كننده ي ژن پروتئين فلوئورسانت سبز به وسيله داروي ضد پاركينسوني دپرنيل

Neuronal differentiation of GFP expressing P19 embryonal carcinoma cells by deprenyl, an antiparkinson drug

زمينه و هدف: سلول های P19 دودمانی از سلول های كار سينومای جنينی چند استعدادی هستند كه قادرند در محيط كشت حاوی سرم رشد نموده و برای تمايز به هر سه دودمان مزودرمی، آندودرمی و اكتودرمی القا شوند. با استفاده از روش های استاندارد ترانسفكشن می توان توالی DNA خارجی را به اين سلول ها وارد كرده و عملكرد و تمايز سلولی را بررسی كرد. اين تحقيق با هدف القای فنوتيپ عصبی در سلول های P19 ترانسفكت شده با ژن پروتئين فلوئورسانت سبز (GFP) با استفاده از داروی ضد پاركينسونی دپرنيل صورت گرفت. روش بررسی: در اين مطالعه توصيفی آزمايشگاهی از روش رسوب كلسيم فسفات جهت وارد كردن پلاسميد pML8 حاوی ژن GFP و ژن مقاوم به پيورومايسين به اين سلول ها استفاده شد. سلول ها با استفاده از محيط كشت MEM-A (Minimum Essential Medium Alpha) حاوی 15 درصد سرم گاوی جنينی كشت داده شدند. در اينجا غلظت 8-10 مولار دپرنيل برای القای تمايز اجسام شبه جنينی به دودمان عصبی استفاده شد. جهت ارزيابی تمايز سلول های P19 بررسی موفولوژی با استفاده از رنگ آميزی اختصاصی كرزيل ويوله انجام شد. به علاوه برای رديابی پروتئين های ويژه سلول های عصبی مانند سيناپتوفيزين و بتاتوبولين III از روش ايمنوفلورسنس استفاده شد. يافته ها: ضمن توليد سلول های P19 ترانسفكت شده پايدار، تمايز عصبی اين سلول ها تحت تأثير عامل القايی دپرنيل انجام شد. نورون های GFP مثبت مشتق شده از سلول های كار سينومای جنينی نشانگرهای ويژه سلول های عصبی را بيان كردند. نتيجه گيری: سلول های تمايز يافته GFP مثبت می توانند در مطالعات پيوندی و پژوهش های پايه ای مرتبط با سلول درمانی و بيماری های تحليل سيستم عصبی مورد استفاده قرار گيرند.

Background and aims: P19 cells are a line of pluripotent embryonal carcinoma stem cells, able to grow continuously in serum-supplemented media and can be induced to differentiate into all three lineage, mesoderm, endoderm and ectoderm. Foreign DNA can be introduced into these cells using of standard methods of transfection, through which to examine the cell function and differentiation. This study aimed to induce neuronal phenotype in P19 cells transfected with GFP gene, using an antiparkinson drug, deprenyl. Methods: In this descriptive study, calcium phosphate precipitation method was used to introduce pML8 plasmid, encoding GFP and puromycin resistance gene, into these cells. The cells were cultured using α-MEM medium, supplemented with 15% fetal bovine serum. Here 10-8 M concentrations of deprenyl was used to induce embryoid body differentiation to neuronal lineage. Cresyl violet staining was used to evaluate the morphology of differentiated P19 cells. In addition, immunofluorescence techniques was used to evaluate neuron specific proteins, synaptophysin and β-III tubulin. Results: In addition to production of stable transfected P19 cells, neuronal differentiation of these cells was carried out by the effect of deprenyl induction. GFP-positive neurons derived from embryonic carcinoma cells expressed neuron specific markers. Conclusion: GFP-positive differentiated cells can be used in transplantation studies and basic researches in association with cell therapy and neurodegenerative diseases.