كلونينگ اپران پلي‌هيدروكسي بوتيرات و ژن E باكتريوفاژ در پلاسميدهاي جداگانه و بررسي عملكرد ژن E در تسهيل توليد پلي‌هيدروكسي بوتيرات در اشريشيا كولي

Cloning of Polyhydroxybutyrate operon and Phage ?x174 E Gene in Separate Plasmids and Analysis of E Gene Function in Facilitating Polyhydroxybutyrate Production in E.coli

مقدمه: بيوپلاستيك پلي‌هيدروكسي بوتيرات كاربرد گسترده در صنايع مختلف و ساخت تجهيزات پزشكي دارد. هزينه‌هاي استخراج و تخليص پلي‌هيدروكسي بوتيرات در اشريشيا كولي، بخش اعظم هزينه‌هاي توليد را به خود اختصاص داده است. ژن E باكتريوفاژ ?x174 با ايجاد تونل غشايي براي ليز باكتري ميزبان استفاده مي‌شود. هدف از انجام اين مطالعه، بررسي عملكرد ژن E در ايجاد تونل غشايي و رهاسازي پلي هيدروكسي بوتيرات توليدشده در اشريشيا كولي مي‌باشد. مواد و روش‌ها: در اين مطالعه، اپران پلي هيدروكسي بوتيرات بعد تكثير اوليه با واكنش زنجيره پلي‌مراز توسط پلاسميد pUC18 كلون و تحت كنترل پروموتور اپران بيان شد. ژن E نيز پس از تكثير با واكنش زنجيره پلي‌مراز توسط پلاسميد pMR103 كلون و تحت كنترل پروموتور T7 بيان گرديد. براي بررسي تشكيل تونل غشايي در باكتري ميزبان از ميكروسكوپ الكتروني استفاده شد. ارزيابي پلي‌هيدروكسي بوتيرات توليدي با كروماتوگرافي گازي و رنگ‌آميزي سودان سياه انجام شد. يافته‌ها: با فعال شدن ژن E و ليز باكتري، جذب نوري نمونه كاهش يافت. در بررسي بقاياي باكتريايي به‌دست‌آمده از محيط كشت باكتري نوتركيب با ميكروسكوپ الكتروني، منافذ غشايي در باكتري‌هاي ليز شده ديده شد. نتايج رنگ‌آميزي سودان سياه و كروماتوگرافي گازي نشان داد كه گرانول‌هاي پلي‌هيدروكسي بوتيرات در اثر ايجاد تونل‌هاي غشايي در محيط كشت آزاد شده است. نتيجه‌گيري: ژن ليز E مي‌تواند براي كاهش هزينه و تسهيل استحصال پلي‌هيدروكسي بوتيرات در باكتري دراشريشيا كولي به‌كار رود كه مي‌تواند در ساخت تجهيزات يكبار مصرف پزشكي و اتاق عمل مورد استفاده قرار گيرد.

Background: Polyhydroxybutyrate is a biodegradable plastic that has widespread application in various industries and in the field of medical equipment production. In E.coli, the most cost of Polyhydroxybutyrate production (PHB) is related to its extraction and purification processes. E gene of Phage ?x174 with conformation of membrane tunnel is used for lysing the hosted bacteria. This study was conducted to investigate the function of E gene in conformation of membrane tunnel and release of produced PHB in E.coli. Materials and Methods: In this study, after amplification with polymerase chain reaction (PCR), PHB operon was cloned by pUC18 while its expression controlled by operon promoter. E gene was amplified with PCR and cloned by pMR103 plasmid while it’s expression controlled by T7 promoter. Lysis process and conformation of membrane tunnel were evaluated by electronic microscope. Analysis of produced PHB was performed by gas chromatography and Sudan staining. Results: With activation of E gene and lysis of bacteria, optical density of specimen decreased. In the analysis of bacterial debris which achieved from E.coli medium by electronic microscope, we observed membrane pores in lysed bacteria. The results of gas chromatography and Sudan staining showed that PHB granules have been released to medium by conformation of membrane tunnel. Conclusion: Lysis E gene can be used for decreasing the cost and facilitating the extraction of PHB in E.coli that can be applied for manufacture of disposable medical and operating room equipment.