مطالعه‏ لايه‏ سطحي و پارا اسپورال ‏بادي ‏‏‏(‏‏‏MH14) ‏‏‏Bacillus thuringiensis Israelensis و پيش‏بيني پايدارسازي ‏‏‏(‏‏‏Cry4Ba) ‏‏‏با ايجاد جهش نقطه‏اي بر اساس يافته‏هاي بيوانفورماتيك

Study of the surface layer and parasporal body of Bacillus thuringiensis Israelensis) MH14) and prediction of Cry4Ba stabilization by point mutation method based on bioinformatics findings

 مقدمه: باسيلوس تورنجينسيس مهم‏ترين‏‏‏ عامل زيستی است كه با توليد پارا اسپورال بادی، ‏‏‏نقش مهمی در مقابله با آفات كشاورزی دارد. ‏‏‏همچنين، لايه‏ سطحی توليد مي‏كند كه ساختاری كريستالی از جنس پروتئين يا گليكوپروتئين است و كاربرد وسيعی در نانوبيوتكنولوژی دارد. ‏‏‏بنابراين، ‏‏‏مطالعه آن دارای اهميت است‏‏. ‏‏‏ مواد و روش‏‏ها: در اين مطالعه، پارا اسپورال بادی خالص‏سازی ‏‏‏شده، مخلوط كريستال/ اسپور با كوماسي‏بلو G250 رنگ‏آميزی و با ميكروسكوپ نوری مشاهده شدند. ‏‏‏با ايجاد جهش نقطه‏ای، ‏‏‏افزايش پايداری در پروتئين CRY4Ba پيش‏بينی شد و جايگاه حفره‏ها در اين پروتئين توسط نرم افزار molegro پيش‏بيني‏شد. در نهايت، لايه ‏سطحی استخراج و شكل و وزن مولكولی آن بررسی شد. ‏‏‏به منظور مقايسه لايه ‏سطحی و پاراسپورال‏بادی، ‏‏‏برخي ويژگي‏های پروتئين آن‏ها توسط پايگاه Protparam تعيين شد. ‏‏‏ نتايج: يافته‏ها گوياي‏‏‏ وجود كريستال‏های پروتئينی چند وجهی بود كه پس از آزاد شدن از اسپور مجتمع مي‏شوند و كريستال‏های درشت‏تر تشكيل مي‏دهند. ‏‏‏همچنين، در اين پژوهش‏‏‏ پيش‏بينی مي‏شود‏‏‏ كه با جايگزينی اسيد آمينه‏ آسپارتيك‏اسيد موقعيت 451 با ايزولوسين، ‏‏‏پروتئين مقاوم‏تر كشنده حشرات CRY4Ba ايجاد مي‏شود‏‏‏. ‏‏‏اين پروتئين سه زير واحدی حاوي 59 حفره است و همانند لايه‏سطحی از همين سويه، ‏‏‏درصد حضور اسيدهای آمينه‏ متيونين، ‏‏‏هيستيدين، ‏‏‏سيستئين و تريپتوفان درآن بسيار پايين است. ‏‏‏ بحث و نتيجه‏گيری: باسيلوس تورنجينسيس در فاز اسپورزايی، كريستال‏های كشنده حشرات توليد مي‏كند كه اين كريستال‏ها پس از رها شدن از اسپور مجتمع مي‏شوند و كريستال‏های درشت‏تر را تشكيل مي‏دهند. ‏‏‏پيش‏بينی مي‏شود‏‏‏ كه جايگزينی آسپارتيك‏اسيد موقعيت 451 با ايزولوسين، ‏‏‏موجب افزايش پايداری پروتئين CRY4Ba مي‏شود. ‏‏‏اين باكتری در فاز رويشی پروتئين سطحی KD100 توليد مي‏كند كه از لحاظ ريخت‏شناسی و درصد برخی اسيد‏های آمينه به پارا اسپورال‏بادی شباهت بسياری دارد. ‏‏‏ 

 Introduction: Bacillus thuringiensis is the most important biological agent and by producing parasporal body it acts as a key role against agricultural pests. Furthermore, it produces Surface layer (S-layer) which is a protein or glycoprotein crystalline structure and has wide applications in nanobiotechnology. Accordingly it is significant to study more about this surface layer and toxin. Materials and methods: In this study, purified parasporal body and mixed crystal/ spore were stained with coomasie blue G250 and were observed with light microscope. With a point mutation in CRY4Ba, protein stabilization was predicted and the location of protein cavities were predicted by Molegro software. Finally, the surface layer was extracted and its molecular weight and morphology were determined. To compare the surface layer and parasporal body, some features of them were estimated by the Protparam server. Results: The results confirm the presence of polyhedral crystal proteins which were accumulated to form larger crystals after releasing spores. Also, it is predicted that in this research replacing the aspartic acid position- 451 with isoleucine, a more stable CRY4Ba pesticide protein is probably produced. This protein with three subunits contains 59 cavities and like the surface layer in this strain, it comprises low percent of methionine, histidine, cysteine and tryptophan. Discussion and conclusion: In sporulation phase, Bacillus thuringiensis produces insecticidal crystals that integrate to form larger crystals. It is predicted that replacing the aspartic­ acid position- 451 with isoleucine would ameliorate the stability of CRY4Ba pesticide protein. This bacterium in vegetative phase produces a surface 100 KD protein which is similar to parasporal body in a shape and the percentage of some of amino acid.