همسانه‌سازي ژن SOX2 انساني در ناقل لنتي ويروسي و القاي ژني در سلول‌هاي HEK293T

Cloning of human SOX2 in lentiviral vector and transduction of HEK293T cell line

چكيده سابقه و هدف ژن SOX2 در ميان گونه‌ها، حفاظت شده بوده و از فاكتورهاي مهم در القاي سلول‌هاي پيش‌ساز از سلول‌هاي تمايز يافته مي‌باشد كه موجب حفظ خاصيت پرتواني سلول‌هاي پيش‌ساز مي‌شود. SOX2 ، OCT4 ، cMYC و KLF4 سبب باز برنامه‌نويسي سلول‌هاي سوماتيك به سلول‌هاي بنيادي مي‌شوند. امروزه از ژن SOX2 در جهت توليد سلول هاي iPS و سلول درماني استفاده مي‌شود. در اين تحقيق همسانه‌سازي ژن SOX2 در ناقل لنتي ويروس و آلوده‌سازي سلول‌هاي HEK293T بررسي شد. مواد و روش‌ها در يك مطالعه تجربي، توالي كدكننده ژن SOX2 سنتز و در ناقل همسانه‌سازي pUC57 دريافت گرديد. ژن ساختـه شده در ناقل بياني لنتي ويروس pLEX-MCS ساب ـ كلون شد. سازه نوتركيب توسط روش‌‌هاي PCR ، هضم آنزيمي و توالي‌يابي تاييد شد. ذرات لنتي ويروس در سلول‌هاي توليد كننده HEK293T توليد شدند. از وكتور لنتي ويروسي حاوي ژن GFP به عنوان كنترل استفاده شد. سلول‌هاي HEK293T توسط ذرات ويروسي آلوده شده و به وسيله مقاومت به آنتي‌بيوتيك پورومايسين انتخاب گرديدند. بيان SOX2 در سلول‌هاي HEK293T توسط RT-PCR بررسي شد. يافته‌ها سازه نوتركيب بيان‌كننده SOX2ساخته و تاييد گرديد. سلول‌هاي HEK293T توسط ذرات ويروس آلوده شدند و پس از 24 ساعت، بيش از 90% سلول‌هاي HEK293T بيان GFP را از خود نشان دادند. با استفاده از روش RT-PCR بيان SOX2در سلول‌هاي HEK293T تاييد شد. نتيجه گيري سلول‌هايHEK293T با موفقيت سازه‌هاي نوتركيب را دريافت و ژن‌هاي GFP و SOX2را بيان نمودند.

Abstract Background and Objectives Recently the regenerative stem cell-based therapy has held great promise in treating severe degenerative diseases. SOX2 gene is highly conserved among species and plays an important role in maintenance of self renewal capacity in stem cells. SOX2 concomitant with OCT4, cMYC, and KLF4 is recruited to reprogram somatic cells towards stem cells. Today SOX2 is frequently being used in induced pluripotent stem cells generation and desired cell based therapies. The aim of this study was to clone SOX2 gene in lentiviral vector and evaluate HEK293T transduction. Materials and Methods In the present experimental study, the coding sequence of human SOX2 gene was synthesized and received in pUC57 cloning vector. The synthesized cDNA was sub-cloned into pLEX- MCS Lentiviral vector. Lentiviral particles were produced in HEK293T cells and subsequently the HEK293T were transducted and infected cells were selected by their resistance to puromycin in the culture. Expression of SOX2 was evaluated in infected HEK293 cells by using Real-Time PCR. Results Constructs expressing SOX2 gene were produced and confirmed. HEK293T was successfully transducted by lentiviral particles and after 24 hours more than 90% of HEK293T represented the expression of GFP. Real-Time PCR confirmed SOX2 expression in infected HEK293 cells. Conclusions HEK293T wase transducted and expressed GFP and SOX2 successfully.