همسان‌سازي و بيان نوتركيب دُمين انتهاي كربوكسيل پروتيين اينتيمين پاتوژن EHEC در باكتري اشرشيا كلي سويه BL21(DE3)

Cloning and Recombinant Expression of Intimin C-Terminal Domain of EHEC Pathogen in E. coli BL21(DE3) Strain

زمينه و هدف: بخشي از عفونت‌هاي روده‌اي به‌واسطه پاتوژن‌هايي به‌وجود مي‌آ‌يند كه با مصرف مواد غذايي آلوده وارد سيستم گوارش انسان مي‌شوند. در لانه‌گزيني باكتري E. coli O157:H7 در روده بزرگ مجموعه‌اي از پروتيين‌ها كه برخي از آنها شروع‌كننده اين فرآيند بوده و فقدان آنها مانع از اين پديده مي‌شود، دخيل هستند. هدف از انجام اين پژوهش همسان‌سازي و بيان نوتركيب پلي‌پپتيد انتهاي كربوكسيل پروتيين اينتيمين به طول 311 اسيد آمينه به‌عنوان كانديد واكسن عليه E. coli O157:H7 بوده است. . روش بررسي‌: طراحي پرايمر اختصاصي براي ژن eae با استفاده از نرم‌افزارOligo نسخه 7 انجام شد و تكثير ژن به‌وسيله واكنش PCR از روي DNA الگو صورت گرفت. واكنش‌هاي هضم آنزيمي ‌و الحاق ژن، درون وكتور pET28a(+) انجام شد. پس از تاييد همسان‌سازي ژن، بيان نوتركيب پروتيين اينتيمين با استفاده از القاگر IPTG صورت گرفت. براي تاييد پروتيين اينتيمين، آناليز وسترن بلات انجام شد. يافته‌ها: همسان‌سازي ژن eae درون وكتور pET28a(+) به شكل مناسب بين جايگاه‌هاي مطلوب انجام شد و پروتيين اينتيمين پس از القا، بيان نوتركيب مناسب و قابل‌توجهي را نشان داد. آنتي‌بادي مورد استفاده در وسترن بلات نيز توانست به شكل مناسبي اينتيمين را شناسايي كند. نتيجه‌گيري: در اين مطالعه، سازه پايدار محتوي ژن eae ساخته شد كه بيان نوتركيب قابل‌توجهي از پروتيين اينتيمين را از خود نشان داد. بنابراين، اين سازه را مي‌توان براي توليد پروتيين اينتيمين جهت مطالعات ايمني‌زايي عليه E. coli O157:H7 به‌كار برد.

Background and Objectives: Some intestinal infections are caused by pathogens that enter the gastrointestinal tract of humans by consumption of contaminated food. A set of proteins are involved in colonization of E. coli O157:H7 in the large intestine, some of which initiate this phenomenon and their absence prevents it. The aim of this study was cloning and recombinant expression of C-terminal polypeptide of intimin, with a length of 300 amino acids, as a vaccine candidate against E. coli O157:H7. Methods: Specific primers for eae gene were designed using Oligo software version 7.0 and gene amplification was performed by PCR from template DNA. Enzymatic digestion and gene ligation were performed in pET28a(+) vector. Recombinant expression of intimin was done by IPTG inducer following the cloning confirmation. Western blotting analysis was performed to confirm the intimin protein. Results: Cloning of eae gene in the pET28a (+) vector was performed appropriately among desired sites, and intimin protein had a proper and significant recombinant expression after the induction. Also, the antibody used in western blotting could identify intimin. Conclusion: In this study, a stable construct containing eae gene was synthetized, which showed an appropriate recombinant expression of intimin protein. Therefore, this construct can be used to produce intimin protein for immunization studies against E. coli O157:H7.