بررسي تنوع ژنتيك جدايه هاي قارچ آلترناريا عامل بيماري لكه برگي مركبات به روش IGS-RFLP

Evaluation of genetic variation of the causal agent of leaf spot of citrus (Alternaria sp.) isolates based on RFLP-IGS

سابقه و هدف: امروزه به منظور بررسي تفاوت هاي درون گونه اي و نژادي از روش RFLP ناحيه IGS استفاده مي شود. اين مطالعه با هدف شناسايي گونه هاي بيماري زاي آلترناريا عامل توليد لكه برگي مركبات با استفاده از روش هاي مورفولوژيك و توالي يابي ناحيه ITS1 در شهرستان ممسني و نيز بررسي تفاوت هاي ژنتيكي جدايه هاي اين قارچ بر اساس RFLP ناحيه IGS انجام گرديد. مواد و روش ها: اين پژوهش به صورت مقطعي- توصيفي بر روي70 نمونه برگي گونه ها و ارقام مختلف مركبات داراي علايم ظاهري مانند لكه قهوه اي و لكه برگي جمع آوري شده از باغات مركبات شهرستان ممسني در پاييز سال 1390 انجام شد. نمونه ها بر روي محيط سيب زميني آگار كشت گرديدند. پس از خالص سازي قارچ به روش تك اسپور، شناسايي گونه ها با استفاده از بررسي خصوصيات مورفولوژيك انجام گرفت. اثبات بيماري زايي جدايه ها با استفاده از اصول كخ روي برگ ها صورت گرفت. تكثير نواحيITS1 و IGS با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي انجام پذيرفت. ناحيه ITS1 جدايه ها توالي يابي شدند و ناحيه IGS پس از برش با استفاده از آنزيم هاي برش دهنده با روش RFLP ارزيابي شد. يافته ها: تمامي جدايه هاي مورد بررسي از لحاظ مورفولوژيك و توالي يابي ناحيه ITS1 به عنوان گونه آلترناريا آلترناتا شناسايي شدند. دندروگرام ترسيمي براي الگوهاي برشي آنزيم هاي مورد استفاده، جدايه ها را در 3 گروه متمايز قرار داد. جدايه هايي كه از ارقام پرتقال جمع آوري شده بودند همگي در يك گروه و جدايه هاي ليمو در يك گروه متمايز ديگر قرار گرفتند. همچنين جدايه ليموشيرين ويكوا در يك گروه كاملاً مجزا از ساير جدايه ها قرار گرفت. نتيجه گيري: نتايج نشان داد كه به كارگيري الگوهاي برش آنزيمي ناحيه IGS مي تواند مشكل مربوط به طبقه بندي جدايه هاي آلترناريا آلترناتا مركبات بر حسب نوع ميزبان را كه در حال حاضر مورد بحث بسيار زيادي مي باشد تاحدودي حل نمايد. واژگان كليدي: پرتقال، ليمو، ليمو شيرين،ITS1، آلترناريا آلترناتا.

Background and Objectives: Nowadays RFLP test from IGS region is a used for determination of interspecies diversities. The aim of this study was to determine pathogenic species of Alternaria from leaf spots of citrus in Mamasani region based on morphological and ITS1 sequencing and to determine genetic variation of isolates based on RFLP-IGS. Materials and Methods: This descriptive study was performed on 70 leaf spotted samples collected from different citruses species and cultivars of Mamasany orchards including orange (Valencia, Navel and leaf spoon Cv.), lime and sweet lemon (Wikova and local Cv.) during In autumn 2011. The isolates were cultured on PDA medium and purified by using single spore method and their species were identified based on morphological characters. The pathogenicity of the isolates was evaluated by based on Koch’s rules through exposure of isolates to leaf. DNA was extracted from mycelia by CTAB and the ITS1 and IGS regions were amplified by using specific primers. The ITS1 region was sequenced and the IGS region was digested by HinfI, BsnI, RsaI, BssmI and AluI restricted enzymes. Results: All isolates were identified as Alternaria alternata based on morphological characters and sequencing of ITS1 region. Constructed dendrogram based on RFLP patterns showed existence of three divergent groups in 51% similarity. Orange, lime and sweet lemon isolates grouped in divergent groups. Also Wikova isolates grouped in different clade. Conclusion: The obtained results clearly showed that the enzyme patterns of IGS can reveal the classification defects of Alternaria alternata form citrus hosts.