بيان آنتي بادي مونوكلونال هرسپتين در سلول هاي يوكاريوتي و آناليز كاهش بيان HER2در رده هاي سلولي سرطان پستان

Expression of monoclonal antibody Herceptin in eukaryotic cells and analysis of HER2 Expression reduction in breast cancer cell lines

مقدمه: HER2 از خانواده گيرنده ي تيروزين كينازها مي باشد كه بيان بيش از حد آن در 25-30 % مبتلايان به سرطان پستان ديده مي شود و هرسپتين اولين آنتي بادي مونوكلونال humanized شده بر عليه HER2 مي باشد. توليد اين آنتي بادي تجاري در داخل كشور علاوه بر دستيابي به دانش فني توليد آنتي بادي هاي مونوكلونال مي تواند زمينه ساز تحقيقات در زمينه مسيرهاي سيگنال دهي داخل سلولي فراهم مي آورد. مواد و روش ها: به منظور توليد هرسپتين، توالي نوكليوتيدي دو زنجيره سبك و سنگين هرسپتين سنتز شيميايي شد. سپس زنجيره سنگين و سبك در يك ناقل لنتي ويروسي براي انتقال هر دو زنجيره به سلول يوكاريوتي كلون گرديد. سپس سازه حامل زنجيره سبك و سنگين با استفاده از روش DNA- كلسيم فسفات به سلول هاي مولد ويروس ترانسفكت شد. پس از توليد لنتي ويروس هاي نوتركيب سلول هاي 293T با آن ها آلوده شد. هرسپتين ترشح شده در محيط كشت سلول ها، جمع آوري و تغليظ گرديد. اتصال و تاثيرگذاري هرسپتين بر رده هاي سلولي پستان HER2+ با استفاده از تست ايمونوسيتوشيمي و MTT assay انجام شد. كاهش بيان گيرنده ي HER2 در سلول هاي تيمار شده با هرسپتين با تكنيك RT-PCR انجام شد و نتايج حاصل از آن بر روي ژل آگارز تاييد گرديد.. يافته ها: نتايج آزمايشات هضم آنزيمي كلونينگ صحيح هر دو زنجيره را در وكتور لنتي ويروسي تاييد كرد. نتايج RT-PCR، پس از ترانسفكشن و ترانسدوكشن سلول HEK-293T بيان هر دو زنجيره را در سلول تاييد كرد. نتايج ايمونوسيتوشيمي و MTT assay اتصال و تاثيرگزاري هرسپتين را بر سلول هاي سرطاني تاييد كرد. نتايج PCR در 3 رده ي سلولي مختلف كاهش بيان گيرنده HER2 را در پاسخ به هرسپتين نشان مي دهد. نتيجه گيري: آنتي بادي توليد شده از فعاليت بيولوژيكي اختصاصي در اتصال به گيرنده HER2، مهار بيان و فعاليت بيولوژيكي گيرنده برخوردار است. اين آنتي بادي مي تواند رشد سلول هاي سرطاني را با كاهش بيان گيرنده HER2 مهار و مرگ را در اين سلول ها القا كند.

Background: HER2 belongs to the receptor family of tyrosine kinases whose over expression occurs in 25-30% of breast cancer patients. Herceptin is the first monoclonal antibody against HER2. Material and Method: In order to producing Herceptin, the nucleotide sequence of Herceptin light and heavy chains were chemically synthesized. The sequences were cloned and incorporated into the recombinant lentivirus backbone for Genes transfer to Eukaryotic cells. 293T cells were Transfected with DNA- Ca Phosphate for production of recombinant lentivirus that carries interested genes. Then 293T cells were infected by recombinant lentivirus. In order to demonstration of antibody chains expression and presence of mature antibody in cell media has done with SDS-PAGE. The attachment of the antibody to HER2 in breast cancer cell lines MCF-7, SKBR3 and MDA was examined using immunocytochemistry and MTT viability assay further confirmed the correct functional activity of the antibody. Changes in HER2 expression before and after addition of the antibody were also assessed in cell lines using RT-PCR. Results: The results of our experiments showed that firstly, the Herceptin antibody can be generated using cloning techniques and recombinant lentivirus vectors and correctly folded to maturation and secrete out the mature antibody by HEK-293T cells. RT-PCR results show reduction of HER2 expression in mRNA level. Immunocytochemistry and MTT assay results confirmed attachment and influence of antibody on breast cancer cell lines. Conclusion: Produced antibodies carries biological activity, inhibition of HER2 expression and suppression of HER2 activity, inhibiting breast cancer cell growth via her2 down regulation and induce their death.