آزمون هاي زيستي و مولكولي گياه نخود تراريخته (Cicer arietinum L.) مقاوم به آفت پيله خوار (Helicoverpa armigera Hub.)

Bioassay and molecular tests of transgenic chickpea (Cicer arietinum L.) resistant to Helicoverpa armigera Hub.

آفت پیله‌خوار یكی از عوامل اصلی كاهش عملكرد نخود محسوب می‌شود و انتقال ژن با هدف افزایش مقاومت به این آفت، از اهداف اصلاحی در این گیاه زراعی می‌باشد. یكی از راهبردهای مؤثر برای تولید نخود تراریخته مقاوم به آفت پیله‌خوار، استفاده از سموم طبیعی Cry از باكتری باسیلوس تورینجینسیس است. این سموم قادرند در معده حشرات فعال شده و سیستم گوارشی حشره را مختل نمایند. در مطالعه حاضر بررسی ثبات حضور ژن cry1Ac و بیان آن در نسل های سوم (T3) و چهارم (T4) حاصل از نسل دوم نخود تراریخته با ژن cry1Ac و ژن گزینشگر nptII انجام شد تا بتوان به لاینی دست یافت كه تنها حاوی ژن cry1Ac بوده و ژن nptII بر اثر نوتركیبی بین دو T-DNA از آن تفكیك شود. آزمون PCR از بین 25نمونه مشكوك در نسل سوم به وجود ژن cry1Ac، در 6مورد باند مربوط به ژن cry1Ac و باند مربوط به ژن nptII را در تمامی نمونه ها نشان داد، ولی از بین این 6نمونه، در آزمون RT-PCR تنها در 5مورد ژن cry1Ac در سطح RNA بیان شد. نتایج PCR در طی نسل چهارم حاكی از وجود باند مربوط به ژن cry1Ac در 73مورد و باند مربوط به ژن nptII در81نمونه از 94مورد بود. در10نمونه از گیاهان تراریخته كه حاوی ژن cry1Ac بودند، باند مربوط به ژن nptII مشاهده نگردید كه این نشان دهنده آن بود كه ژن cry1Ac از ژن nptII تفكیك شده است. نتایج آزمون RT-PCR نیز نشان داد كه ژن موردنظر در همه گیاهان تراریخته، در سطح RNA بیان شده است. همچنین نتایج آزمون الایزا نشان داد كه در تمام نمونه های مورد آزمون، پروتئین Cry1Ac در لاین های مختلف در غلظت های متفاوتی بیان شده است. در آزمون زیست‌سنجی، لاروهایی كه با برگ گیاهان غیرتراریخته تغذیه شدند، همگی زنده ماندند، اما در مقابل لاروهایی كه با برگ گیاهان تراریخته نسل T4 تغذیه شدند، همگی به‌طور كامل از بین رفتند كه این امر نشان‌دهندة بروز موفقیت آمیز فنوتیپ مورد انتظار می باشد.

Pod borer is one of the main causes for yield loss of chickpea. Therefore, breeding of chickpea for resistance to this pest is important. The use of Cry toxin from Bacillus thuringiensis is an effective strategy for producing of transgenic resistant chickpea to this pest. These toxins are able to become active in the midgut of larvae and disrupt the insect 's digestive system. We studied the stability and expression of cry1Ac gene obtained as T2 transgenic chickpea with cry1Ac gene and nptII gene with binary T-DNA in T3 and T4 generations of transgenic plants and observed the transgenic lines with cry1Ac gene and no nptII gene suggesting that separation between cry1Ac and nptII genes was occurred by recombination between two T-DNAs. In T3, PCR results showed that 6 of 25 putative transgenic plants had cry1Ac gene but all of them showed the nptII gene. From six samples with positive PCR in cry1Ac gene, five of them had positive results in RT-PCR reaction, confirming the expression of cry1Ac gene in transgenic lines. PCR results in T4 plants showed that 73 of 94 plants had cry1Ac gene and 81 of 94 samples included the nptII gene. In 10 samples cry1Ac gene separated from nptII gene. According ELISA results, in all samples tested, Cry1Ac protein was expressed in different concentrations. Bioassay tests showed that all pod borer larvae fed by leaves of transgenic plants, were dead, but all survived when the larvae were fed with leaves of non-transgenic plants. So, expected phenotype was observed successfully.